Ukena, Kazuyoshi

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学位〈博士）論文要旨 広島大学大学院生物冨科学研究科脊椎動物の脳におけるニュー口ステロイドの生合成と作用に関する研究浮穴和義Biosynthesis and Function of Neurosteroids in the Vertebrate Brain Kazuyoshi UK豆NA要第1章序旨墨＆田岡末梢内分洛腺が分詑、するステロイドは、その脂溶性という物理化学的性状により、脳を保護する車液一越関門を通過して、脳にホルモンとして作用することができる。これまでステロイドは、末務内分泌線がつくるもので、脳はこのホルモンの標的器官として泣童づけられてきた。例えば、生殖隷が分泌する［性ステロイド」は、攻撃、求愛、交震などの一連の生殖行動を誘起する。ところが最近、脳も独自にコレステロールをもとにステロイドを合成していることが明らかになったc この脳が合成するステロイドは、従来の「古典的ステロイドjと区民して「ニューロステロイドjと名付けられた。近年、ニューロステロイドに関する研究は世界的レベルで活発になされるようになったが、得られる靖報は断片的である。本研究では、脊椎動物の臆におけるニューロステロイドの生合成と作用の解明を目的とした総合的かつ系統的解析を行った。第2章 ラットの小脳プルキン工組題におけるこユーロステロイド（プレグネノロンとプレグネノロン硫酸エステん〉の生合或と作用脳がニューロステロイドを合成することが明らかとなり、ニューロステロイドを合成する脳細胞を同定することがこの分野の最重要課題となった。まず、 Baulieuらの靖乳類を用いた生化学的解析により、ニューロステロイドの主な合成部位はグワア細抱であることが示された。一方、Tsutsuiらの嘉類のウズラを用いた研究により、ステロイド合成の第一段階でコレステ訂ールからプレグネノロンへ変換する酵素であるコレステEール傑鎮切断酵素（P450sccチトクロームP450分子種の一種）に対する抗体を用いた免疫組織化学的な解析により、グリア紹胞のみなちずニューロンでもニューロステロイド合成がなされることが示された。そこで本章の研究では、靖乳類のラットを材料としニューロンにおけるニューロステロイドの生合成の証明を行った。ウシの副腎から精製されたP450sccに対する抗体を用いた免疫組織化学的解析により、ラットの脳の連続切片上で最も強く染色されたのは、小脳皮質の分子層と穎粒層の間に並ぶ大型の組砲であった。この細胞は形繋染色とマーカー染色によりプルキンエ細胞であると司定された。本研究により初めて補乳類のニューロンにおけるニューロステロイド合成酵素の存在が証明された。さらに、小脳プルキンエ紹広島大学総合科学部紀要N理系編、第25巻（1999)＊広島大学審査学金論文口頭発表日： 1999年2丹168、学泣取得B 1999年3丹8日202 浮穴和義抱に局在するP450sccの発達過程における変動を明らかにするために、免疫組織北学的解析、ウエスタンプロット解析、まT-PCR法による遺伝子発現の解析を行ったC その結果、 P450scc詰新生期、思春期、或熟期のいずれの時期においてもプルキンエ細胞に発現していることがわかった。また、P450sccの作用により合成されるプレグネノ包ンとその硫酸エステルが小脳に蓄讃されていることもラジオイムノアッセイ法iこより確認した。続いて、プルキンエ結胞が合或するニュー百ステロイドの作用を、新生期のラットとウズラを厚い電気生理学的に解析した。その結果、プルキンヱ細抱から傍分泌されたプレグネノロン読書愛エステルは、プルキンエ縮施に投射しているG店 Aニューロン［抑制性伝達物質のy－アミノ酪酸（G坦，A)を含有するニューロン］に作用し、 GABAニューロンの活動を高めることが見いだされた。プレグネノロン硫酸エステルは、このシナプスにおいてGABAによる需報伝達を修飾することが示唆された。第3章発達過程のラットの小脳プjレキンエ細胞におけるこユーロステロイド〈プロジ‘ェステロン）の一過的な生合成これまで、末梢ステロイド合成器宮では、コレステロールをもとにプレグンネノロンが合成されると、プロジェステロンなどへの代謝が進むことが知られている。そこで、小脳のニューロステロイド合成経諮を明らかにするために辻、 P450sccに加え、健の合成酵素の発現を調べる必要がある Q第2章で述べたようにP450scc＇ま生後の発達過程で、常に小躍のプルキンエ細麹に発現していることがわかった。そこで本章の研究では、プレグネノロンからプロジェステロンを合成する酵素の3f3-水駿基脱水素I~5- ~4異性化酵素（3f3-HSD）の発表と酵素活性を発達過程のラットを用い解析したgRT-PC弐解析の結果、 3(3-HSDのmRNAは新生期に発現が著しく高まることがわかった。さらに小脳スライスを用いて酵素活性を灘定した結果、酵素活性も新生期に高まることが明らかになった。さらに、ラジオイムノアッセイ法により、新生期に小脳内のプロジ‘ヱステロン濃震が高いことも確認された。続いて、 insituハイブリダイゼーション法を用い、 3(3-HSDmRNAの発現部位を解析した。その結果、プルキンエ紹胞と外穎粒層の細胞にmRNAが発現していることがわかった。この新生顛の小脳では顕著な形態変化が起こっており、プルキンエ細胞を中心とした神経団路網が形成されることが知られている。 3{3－司SDが義生顛特異的に発現するという結果から、プロジェステロンが小脳内のニューロンの分化・誘導やシナプス形成に関与していることが示唆された。第4章 ラットの各脳領域と発達過程Lこおけるニュー司ステロイド合或酵素の遺伝子発現本章の研究では、ラットの小脳でのニューロステロイド合成経路の全容を解析するため、ステロイド合成におけるもうlつの要の酵素であるP450cl7 （チトクロームP450分子種のー謹）の遺伝子発現を解析したO このP450c17は、プレグネノロンからデヒドロエピアンドロステロンを、プEジェステロンからアンドヨステンジオンを合成する酵素である。小脳においては、いずれの発達段階でもP450cl7の発現は認められなかったG 小騒で詰プレグネノロンやその硫酸エステルとプロジェステロンが主要なニューロステロイドであり、デヒドロエとアンドロステロンやアンドロステンジ才ンの合成は少ないことが示唆された。本章の研究では、さらに小脳に加え、他の謡領域である大脳、間脳、中脳について、ニューロステロイド合成における要の酵素であるP450scc,3{3-HSD, P450cl 7の遺伝子発現を生後の発達段階で1 併審議警担圃圃園署曹置曹司咽R・ 喜Tl 『' 脊誰動物の脳におけるニューロステロイドの生合或と作用に関する硬究 203 主T-PCR法により解析したO その結果、 P450sccはいず、れの脳領域において全ての発達段階で発現していることがわかった。 3(3-HSDは、薪生期に小脳と大脳で発現が認められた。 P450cl7は、恒常的に中脳にのみ発現が認められたO なお、これらの遺伝子発現には、性差は認められなかった。以上の結果から、脳において蔀位特異的、時期特異的なニューロステヨイド会或が示襲きれた。本研究成果辻、ニュー口ステロイドの生理機能を解析する上で、重要な手がかりを提供するものである。第5章鳥類の脳におけるこユーロステロイドの生合成本章の研究では、脳におけるニューロステロイド合成は高等脊椎動物に一般化できる重要な現象であることを証明した。まず鳥類のウズラを用いニューロステロイドの生合成を検討した。先行研究により、ウズラの脳には、 P450sccが発現しており、コレステロールをもとにプレグネノロンがつくられることを報告している。そこで、それ以降の代謝経路を解暁するために、 3(3-HSDの発現と酵素活性を各魁領域で調べた。その結果、ウズラの脳には3(3-HSDの遺伝子発現が確認され、さらに酵素活性は大脳と関脳で強く中脳で弱いことがわかった。 3{3-HSDの酵素反応によりつくられるプロジェステEンの濃度も大脳と関脳で高いことが明らかになった。第6章再生類の脳におけるこユーロステロイドの生合或とその季節変動本章の訴究では、下等脊椎動物である再生類のゼノパスを吊い、ニューロステロイドの生合或を検討した。まず、プレグネノロンとプレグネノロン硫酸エステルの脳、生殖線、血禁中の濃度をラジオイムノアッセイ法により灘定した。その結果、脳において高濃度にこれらのニューロステロイドが蓄積されていることがわかった。さらに、 P450sccの楢内局在を解析した結果、関脳の提床下部の纏砲や小脳のプ｝！.；キンヱ組胞なと1こP450sccの免疫陽性反応が検出された。従って、脳におけるニューロステロイド合成は下等脊椎動物でも証明され、脊誰動物に一般化できる重要な現象であることが示された。さらに、野生両生類のトノサマガエルを用い、ニューロステロイドの脳内季節変動を調べた結果、繁殖期にプレグネノロン硫酸エステル濃度が高くなることが明らかになったc野生動物が示すニューロステロイドの季第変動は、初めて発克されたニューロステロイドの生理的変動である。第7章総合考察本研究により、靖乳類、鳥類、詞生類の脳が独自にニューロステロイドを合成していることを註明し、脳におけるニューロステロイド合成誌脊椎動物に一般化できる重要な現象であることを明らかにした。また、これまで、ニューロステロイドの合成細抱はグリア細胞であると考えられていたが、本研究により、小脳皮費ニューロンであるプルキンエ細胞が活発にプレグネノロン、プレグネノロン硫酸エステル、プロジェステロンなどのニューロステロイドを合成することを発晃したc プルキンエ細胞は記’撞能力を有するニューロンであり、このニューロンで起こる長顛増強や長期抑圧といったシナプスの可塑性により学奮・記’患がなされると考えられている。この記龍ニューロンがつくるニューロステロイドが、学習・記曜の制御に関与している可能性がある。本研究では、プレグネノロン硫酸エステルが情報伝達を謂諒していることを明らかにした。今後は、ニューロステロ204 浮穴和義イドの作用を長期増強や長期抑圧との関連から電気生理学的に解析を進める予定である。また、遺伝子操作により人為的に小脳内のニューロステロイドレベルを操作し、ニューロステロイドの学習・記’護機講に対する効果を行動レベルからも解析する予定であるc一方、プレグネノロンからプロジェステロンに変換する酵素の3~－HSDがラットの小脳で新生期の限られた持期にその発現と活性が高まるということを明らかにしたc新生期に活発に生合成されるプロジ、エステロンは、小脳内のニューEンの分化・誘導やシナプス形成を導く可能性が高い。今後は、新生期のラットの小脳スライスの培養細砲を確立し、プロジェステEン護度を人為的に変化させシナプス影成と神経由蕗形成を諜べる予定である。さらに本研究では、野生脊椎動物の脳内ニューロステロイドレベルが季節変動を示すことを明らかにした。繁殖期にプレグネノヨン硫酸エステル濃度が増加する生理的意義の解明やニューロステロイド合戒を制御する環境因子の同定などについて、研究を進める予定である。． ? ，? ?? ??????? ? ?＇~ 

<Summary of Doctorate>Biosynthesis and Function of Neurosteroids in the Vertebrate Brain

Hiroshima University Institutional Repository

<学位論文要旨>脊椎動物の脳におけるニューロステロイドの生合成と作用に関する研究

http://ir.lib.hiroshima-u.ac.jp/files/public/4/42387/20170210093353844865/KJ00000197436.pdf

<Summary of Doctorate>Biosynthesis and Function of Neurosteroids in the Vertebrate Brain

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