The role of NOX4 in skin fibroblasts

Abstract

Differentiation of fibroblasts to myofibroblasts consists of a phenotypic conversion to α-smooth muscle actin (α-SMA)-positive, highly contractile cells, which secrete proteins of the extracellular matrix (ECM). This differentiation process is crucial for physiological wound healing, as myofibroblasts are responsible for the restoration of damaged tissue and wound closure. Exaggerated, abnormal myofibroblasts activity is associated with the development of fibrosis. TGF-β is the most potent growth factor involved in fibroblasts-to-myofibroblasts conversion. Several studies indicated that the H2O2-generating NADPH oxidase 4 (NOX4) mediates TGF-β-dependent myofibroblasts differentiation during the development of pathological fibrosis in different organs. The profibrotic role of NOX4 has intensively been studied, but its role in physiological skin wound healing has not been described. The hypothesis of this thesis was that NOX4 regulates physiological skin wound healing. In order to investigate this hypothesis, both in vivo and in vitro approaches were applied. Skin wounds were created on the NOX4 KO and WT mice and the time of wound closure, wound size, epithelization, and contraction were determined. Immunohistochemical staining was performed to quantify α-SMA, cellular infiltration, and collagen content in the wounds. This in vivo study did not show any influence of NOX4 deletion on skin wound repair. In vitro, NOX4 KO fibroblasts were compared to WT fibroblasts in terms of proliferation capacity, cell viability and myofibroblast characteristics following TGF-β2 simulation. NOX4 KO fibroblasts differentiated into myofibroblasts similarly to WT fibroblasts, as confirmed by up-regulation of α-SMA expression, stress fibers formation, and increased contraction capabilities. To confirm this phenomenon, we used different genetic systems, where NOX4 is inactive, namely p22phox-deficient mouse fibroblasts, human fibroblasts treated with siRNA directed against NOX4, and human fibroblasts isolated from a patient with p22phox mutation. Upon stimulation with TGF-β1/2, they all exhibited up-regulation of α-SMA and formation of stress fibers, without any significant difference, when compared to their respective control cells. Nevertheless, TGF-β1/2 robustly induced NOX4 expression in both human and mouse fibroblasts. Thus, in order to examine the role of TGF-β-induced NOX4 expression, RNA sequencing was performed, using primary fibroblasts from NOX4 KO and WT mice. This approach confirmed previous results: TGF-β2 treatment led to increased expression of typical myofibroblastic markers and initiation of pathways associated with a cytoskeletal organization and ECM structure, in both WT and NOX4 KO fibroblasts. However, RNA sequencing revealed significant up-regulation of Ucp2 and Hddc3 and down-regulation of Islr in TGF-β-stimulated NOX4 KO fibroblasts. Ucp2 is an inner mitochondrial protein widely studied especially for its role in glucose metabolism and stress response, while Hddc3 and Islr functions are mostly unknown. Thus, fibroblast metabolic parameters were examined. NOX4 KO fibroblasts showed increased mitochondrial staining, while TGF-β2-stimulated NOX4 KO fibroblasts exhibited upregulated glycolysis. For the first time, this study documented NOX4-mediated upregulation of Ucp2 expression and the role of NOX4 in the regulation of cellular metabolism. Altogether, this study provides a strong argument that NOX4 does not play a key role in physiological skin wound healing and myofibroblast differentiation, however, it indicates a novel function of NOX4 in stress-response and metabolism of fibroblasts.La différenciation des fibroblastes en myofibroblastes consiste en une conversion phénotypique des fibroblastes en cellules positives pour le marqueur “α-smooth muscle actin” (α-SMA), hautement contractiles et qui sécrètent des protéines de la matrice extracellulaire. Ce processus de différenciation est crucial pour la cicatrisation physiologique des plaies, car les myofibroblastes sont responsables de la restauration des tissus endommagés et de la fermeture des plaies. Une activité exagérée et anormale des myofibroblastes est associée au développement de fibroses. Le TGF-β est le facteur de croissance le plus puissant impliqué dans la conversion des fibroblastes en myofibroblastes. Plusieurs études indiquent que la NADPH oxydase 4 (NOX4), génératrice de H2O2, contrôle la différenciation des myofibroblastes lors de fibroses de nombreux organes. Le rôle pro-fibrotique de NOX4 a été intensivement étudié, mais son rôle dans la cicatrisation physiologique des plaies cutanées n'a pas été décrit. L'hypothèse de cette thèse était que NOX4 régule la cicatrisation physiologique des plaies cutanées. Afin d'étudier cette hypothèse, des approches in vivo et in vitro ont été appliquées. Des plaies cutanées ont été créées sur des souris NOX4 KO et WT et le temps de fermeture de la plaie, la taille de la plaie, l'épithélisation et la contraction ont été mesurés. Une coloration immunohistochimique a été réalisée pour quantifier l'α-SMA, l'infiltration cellulaire et la teneur en collagène des plaies. Cette étude in vivo n'a montré aucune influence de la délétion de NOX4 sur la réparation des plaies cutanées. In vitro, les fibroblastes NOX4 knockout (KO) ont été comparés aux fibroblastes sauvages (WT) en termes de capacité de prolifération, de viabilité cellulaire et de caractéristiques myofibroblastiques suite à la simulation TGF-β2. Les fibroblastes NOX4 KO se sont différenciés en myofibroblastes de la même manière que les fibroblastes WT, tant au niveau de la surexpression de α-SMA, de la formation de fibres de stress et de l'augmentation des capacités contractiles. Afin de confirmer cette observation, nous avons utilisé différents systèmes génétiques où NOX4 est inactivé, à savoir des fibroblastes de souris déficientes en p22phox, des fibroblastes humains traités avec des siRNA dirigés contre NOX4 et des fibroblastes humains isolés de patients porteurs d’une mutation p22phox. Lors de la stimulation avec TGF-β1/2, tous ont présenté une surexpression de α-SMA et la formation de fibres de stress de façon similaire à leurs cellules témoins respectives. Malgré tout, le TGF-β1/2 induit fortement l'expression de NOX4 dans les fibroblastes humains et murins. Ainsi, afin d'examiner le rôle de la surexpression de NOX4 induite par le TGF-β, un séquençage d'ARN a été réalisé en utilisant des fibroblastes primaires de souris NOX4 KO et WT. Cette approche a confirmé les résultats précédents : le traitement par TGF-β2 induit une surexpression de marqueurs myofibroblastiques et des voies associées à l'organisation du cytosquelette ainsi qu’à la structure de la ME dans les fibroblastes tant WT que NOX4 KO. Cependant, le séquençage de l'ARN a révélé une surexpression s de Ucp2 et Hddc3 dans les fibroblastes NOX4 KO. Ucp2 est une protéine de la paroi interne des mitochondries largement étudiée, notamment pour son rôle dans le métabolisme du glucose et la réponse au stress, tandis que la fonction de Hddc3 est en grande partie inconnue. Ainsi, les paramètres métaboliques des fibroblastes ont été examinés. Les fibroblastes NOX4 KO ont une plus grande quantité de mitochondries, tandis que les fibroblastes NOX4 KO stimulés par le TGF-β2 ont une glycolyse accrue. Cette étude montre pour la première fois, une surexpression d'Ucp2 régulée par par NOX4 et un rôle de NOX4 dans la régulation du métabolisme cellulaire. Dans l'ensemble, cette étude fournit un argument solide selon lequel NOX4 ne joue pas un rôle clé dans la cicatrisation physiologique des plaies cutanées et la différenciation des myofibroblastes, cependant, elle indique une nouvelle fonction de NOX4 dans la réponse au stress et le métabolisme des fibroblastes