Ziel des Projekts war die Aufschlüsselung der in vivo-Funktionen der drei bekannten A. thaliana 4-Cumarat:CoA Ligasen. In silico Untersuchungen führten zur Entdeckung einer weiteren, wahtscheinlich letzten Isoform, At4CL4. Nach phylogenetischen und genomischen Analysen konnte At4CL4 den Klasse I-4CLs zugeordnet werden und ein Modell wurde vorgeschlagen, das die Evolution der At4CL-Familie beschreibt. At4CL4 wurde heterolog exprimiert und enzymkinetisch als bona fide 4CL charakterisiert mit der besonderen Fähigkeit in vitro Sinapinsäure zu aktivieren. Der At4CL4-katalysierten Aktivierung von Sinpinsäure bzw. Ferulasäure könnte eine Rolle im Stoffwechselweg zu den Sinpat-Derivaten oder Ligninvorstufen zukommen. Auf RT-PCR Ebene wurde die mRNA-Akkumulation der At4CLs untersucht. At4CL4 zeigte ein Muster grundsätzlich ähnlich dem der At4CL1 und der At4CL2 Dieses lässt eine in vivo Funktion der At4CL4 assoziiert mit der Synthese von Ligninvorstufen und anderen phenolischen Verbindungen erwarten. Neben der bereits existierenden At4CL1-Nullmutante wurde zu jedem weiteren Mitglied der At4CL-Familie mindestens eine weitere Linie isoliert, molekularbiologisch und biochemisch charakterisiert. In methanolischen Extrakten löslicher Sekundärmetabolite aus Wurzeln der At4CL1 Mutante wurde Akkumulation einer Verbindung mit einem UV-Spektrum ähnlich dem des Cumarins nachgewiesen In den HPLC-Profilen der At4CL3-Nullmutante wurde die Reduktion, nicht aber vollständiges Fehlen von Flavonoiden nachgewiesen. Die Ausprägung des At4CL3-Nullmutanten-Phänotyps war in verschiedenen Organen und Entwicklungsstufen unterschiedlich stark. Auch konnte keine UV- induzierbare Akkumulation von Flavonoiden in der At4CL3-Nullmutante gezeigt werden. Eine Funktion der At4CL3 kann daher in in der Aktivierung von Flavonoid-Vorstufen in jungen Pflanzen und nach UV-Perzeption bestehen. Um die funktionellen Redundanzen zu überwinden, wurden multiple Nullmutanten der At4CLs mit Mutanten der Gene AtCHS und AtF5H generiert, um weitere strategische Punkte des Metabolitenflusses abzudecken. Morphologische und biochemische Charakterisierung ausgewählter Mutanten zeigte, dass ein homozygoter Defekt von At4CL1 und At4CL2 zum Stagnieren der pflanzlichen Entwicklung im Alter von 5-6 Wochen führte. In HPLC-Profilen konnte hier die spezifische Akkumulation von drei Verbindungen nachgewiesen werden, die vermutlich 4-Cumarat- und Ferulat-Derivate darstellen. Daraus wurde geschlossen, dass die Funktionen von At4CL1 und At4CL2 in der Synthese von Ligninvorstufen und weiteren phenolischen Verbindungen der späten Entwicklungsstadien bestehen
