Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Bereitstellung der zur Identifizierung von Inhibitoren des inflammatorischen
und angiogenetischen Chemokins CXCL8 benötigten Assaykomponenten. Aufbauend auf diesen
sollte ein häufig verwendeter Aktivitätsassay basierend auf intrazellulärer Calciumfreisetzung etabliert werden
und die Übertragbarkeit des für Bindungsstudien traditionell eingesetzten Radioligand-Assays auf eine
auf Messung der Fluoreszenzanisotropie basierende Durchführung geprüft werden.
Durch Transfektion von HEK293-Zellen mit der cDNA des CXCR1 oder CXCR2 konnten mehrere, jeweils
einen der Rezeptoren stabil exprimierende Einzelklone selektiert und kultiviert werden. Der Nachweis
der Rezeptorexpression wurde durchflusszytometrisch und mittels Western-Blot-Analyse durchgeführt, wobei
falsch-positive Ergebnisse letztlich mittels konfokaler Mikroskopie identifiziert wurden. In Kombination
dieser drei immunologischen Nachweise wurden die Zelllinien HEK293/CXCR1-C11 und HEK293/CXCR2-
IIH8 als vielversprechender Ersatz für neutrophile Granulozyten, welche eine hohe endogene Expression der
beiden Rezeptoren aufweisen, bereit gestellt. Zur Bestätigung der biologischen Aktivität der Rezeptoren
wurde ein Calcium-Assay mit frisch isolierten neutrophilen Granulozyten etabliert und auf die adhärenten,
transfizierten HEK293-Zellen erfolgreich übertragen. Hierzu wurden sowohl Negativkontrollen bezüglich
der Zelllinie und damit Rezeptoren mit den (humanen) CXCR1 und CXCR2 nicht endogen exprimierenden
CHO-Zellen als auch der Ligandlösung durch Injektion des Tripeptids fMLP durchgeführt. Der Zusatz
von BSA zum Puffer zur Reduzierung unspezifischer Wechselwirkungen des Proteins und der Inhibitoren
zu Gefäßwänden wurde ebenfalls untersucht und ermöglichte die Inhibierung des durch CXCL8 ausgelösten
Signals bei der Durchführung des optimierten Assays bei Injektion physiologischer Konzentrationen des
Chemokins. In diesem Zusammenhang wurde auch bestätigt, dass BSA selbst keinen Anstieg der intrazellulären
Calciumkonzentration auslöst. Zusätzlich wurde dieser Assay sowohl mit neutrophilen Granulozyten
als auch den transfizierten, CXCR1 exprimierenden Zellen, zur Bestätigung der Aktivität des im Arbeitskreis
von Dorothea Helmer synthetisierten Inhibitorpeptids CXCL8-RPLoops eingesetzt.
Zusätzlich konnten die CXCR1 stabil exprimierenden Zellen im Arbeitskreis zur Etablierung eines
Chemotaxis-Assays im Transwell-Format genutzt werden, durch welchen die biologische Aktivität der Rezeptoren
nochmals bestätigt werden konnte.
Zur Durchführung von Bindungsstudien wurden verschiedene Methoden zur Anfertigung von Membranpräparationen
der Zelllinien verglichen und die Rezeptoren mittels Western Blot-Analyse dieser Membranpräparationen
in diesen in Form jeweils einer Monomer- und Dimerbande des jeweiligen Rezeptors
nachgewiesen. Hierbei konnte auch gezeigt werden, dass die hier verwendeten HEK293-Zellen den Rezeptor
des Chemokins CXCL12, CXCR4, endogen exprimieren und dieser mit CXCR1 Heterodimere bildet.
Neben dieser Etablierung der die Rezeptoren exprimierenden Zelllinien und deren Membranpräparationen
wurde der Ligand, CXCL8, sowie eine Mutante, CXCL8S72C, durch Modifizierung der im Arbeitskreis bereits
etablierten rekombinanten Expression hergestellt und chromatographisch gereinigt. Die genannte Proteinmutante
wurde mit verschiedenen maleimid-funktionalisierten Fluorophoren, Fluorescein-5-Maleimid,
CFTM633-Maleimid und DyLight®550-Maleimid (DL550) konjugiert. Zusätzlich wurde ein Rutheniumkomplex
als Langzeitfluorophor mit einem bifunktionalen Linker versehen und ebenfalls mit CXCL8S72C konju-
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giert. Ein Vergleich der verschiedenen Proteinkonjugate zeigte, dass sich CXCL8S72C-CFTM633 hier nicht
zur Messung der Fluoreszenzanisotropie eignet. Sowohl mit CXCL8S72C-DL550 als auch CXCL8S72CFluorescein
konnten Bindungskurven bei Inkubation des Proteinkonjugats mit unterschiedlichen Konzentrationen
an Membranpräparation dargestellt werden, obgleich der orange-gelbe Farbstoff eine zu geringe
dynamische Breite und zudem unterschiedliche Werte der Fluoreszenzanisotropie des freien Tracers zeigte.
Dies könnte mit einem zu beweglichen Fluorophor am Protein (Propellereffekt) und hieraus unterschiedlichen
Konformationen des Fluorophors am Protein (starr am Protein gebunden und frei beweglich) erklärt
werden.Während Fluorescein selbst keineWechselwirkung mit der Membranpräparation einging, ist die beobachtete
Bindung von CXCL8S72C-DL550 zudem auf die Bindung des Farbstoffs DyLight®550-Maleimid
zurückzuführen, weshalb sich dieses Proteinkonjugat aus mehreren Gründen zusammenfassend ebenfalls
nicht zur zukünftigen Optimierung eines Fluoreszenzanisotropieassays eignet. Der Zusatz von BSA zur Reduktion
unspezifischer Wechselwirkungen, ähnlich zur Durchführung des Calcium-Assays, ist wegen einer
Wechselwirkung des Fluoresceinkonjugats mit diesem Protein nicht möglich. Zusätzlich wurde eine weitere
Methode zur Quantifizierung unspezifischer Wechselwirkungen, die Zugabe eines Überschusses an nicht
markiertem CXCL8 getestet. Aufgrund der bekannten Dimerisierung des Chemokins wurde die Bindung
zwischen markiertem und unmarkiertem CXCL8 untersucht und im verwendeten Puffer (TRIS-T) mit
beiden Tracern, CXCL8S72C-Fluorescein und CXCL8S72C-DL550, eine Bindungsaffinität von etwa 1μM
ermittelt, wodurch sich die Verwendung des Chemokins als sogenannter kalter Ligand erübrigt.
Zusammenfassend stehen im Arbeitskreis nun sowohl CXCR1- als auch CXCR2-stabil exprimierende Zelllinien
als auch mit verschiedenen Fluorophoren konjugierte Varianten der Chemokinmutante CXCL8S72C
zur Verfügung, welche für weitere Aktivitäts- und Bindungsassays eingesetzt werden können. Die zukünftige
Etablierung eines Fluoreszenzanisotropieassays zum Screening kleiner Inhibitoren des Chemokins scheint
letztlich möglich, jedoch muss einerseits die Bindung des CXCL8 an GAGs als auch die Dimerisierung
dieses Chemokins bei der Etablierung beachtet und hierfür geeignete Lösungen gefunden werden. Bezüglich
der hier hergestellten Konjugate sollten für einen solchen Assay Fluorophore mit einer höheren
Quantenausbeute gewählt werden, damit die zur korrekten Berechnung der Dissoziationskonstanten nötige
Tracerkonzentration kleiner der bekannten Dissoziationskonstanten eingesetzt werden kann
