Emploi du double hybride de levure pour confirmer les interactions entre 2 protéines de Myzus persicae et les protéines structurales du BWYV

Abstract

National audienceLe Beet western yellows virus (BWYV) est un polerovirus (Luteoviridae) qui est transmis par Myzus persicae de manière circulante non-multipliante. Une fois ingérées, les particules virales doivent obligatoirement franchir l’épithélium de l’intestin moyen puis celui des glandes salivaires accessoires afin d’être transmises à une nouvelle plante hôte. Ces deux étapes de transcytose (endocytose/exocytose) des virions au travers du puceron-vecteur requièrent des interactions spécifiques entre les particules virales et des récepteurs localisés au niveau des deux épithéliums (intestin et glandes salivaires accessoires). Des expériences de far-Western blot ont été réalisées à partir de protéines (totales, membranaires et/ou solubles) extraites de Myzus persicae [1] et ont permis, après séquençage par spectrométrie de masse, l’identification de plusieurs candidats homologues à certaines protéines de Drosophila melanogaster dont Rack1 (Receptor for Activated C Kinase 1) et Gapdh3 (GlycerAldehyde-3-Phosphate DesHydrogenase). Bien qu’aucune de ces deux protéines ne soit probablement le récepteur membranaire (extracellulaire) du BWYV, elles interviendraient plus ou moins indirectement dans les mécanismes de transcytose et pourraient ainsi participer activement au passage du BWYV dans le corps du puceron-vecteur. Les tests d’interaction réalisés avec différents mutants du BWYV suggère que Rack1 interagit avec un motif spécifique de la protéine mineure de capside (la RT : ReadThrough) qui est impliquée dans l’efficacité d’endocytose des virions au niveau intestinal. Gapdh3, à l’inverse, interagit avec tous les virus mutés Ŕ même ceux délétés du domaine de readthrough (DRT) Ŕ vraisemblablement par le biais de la protéine majeure de capside (la CP). Afin de confirmer ces interactions observées par far-Western blot, nous avons utilisé un système split-ubiquitin de double hybride de levure, le « mbSUS ». Les protéines appâts (CP ou DRT) ont été fusionnées à la partie C-ter de l’ubiquitine (Cub), elle-même en fusion avec un facteur de transcription synthétique (PLV). Celui-ci est uniquement libéré par clivage lorsqu’il y a interaction de l’appât avec une proie fusionné à la partie N-ter de l’ubiquitine (Nub) ce qui permet l’action de protéases spécifiques reconnaissant l’ubiquitine (entière). La libération du facteur de transcription induit l’activation des gènes rapporteurs du système permettant, entre autre, la croissance des levures sur un milieu spécifique. Le génome d’Acyrthosiphon pisum étant maintenant disponible et les EST pour Myzus persicae assez nombreux, nous avons pu identifier chez M. persicae les gènes codant pour les protéines Rack1 et Gapdh3. Les séquences de ces deux gènes ont été fusionnées à la partie N-ter de l’ubiquitine (Nub) et serviront de proie dans les expériences de double hybride. Les expériences sont en cours, résultats sur le poster