Karyotype pattern of the cells persistently infected with small plaque variant viruses isolated from ECHO virus type 11 (gregory strain) was studied after several passages of subculture. The results are as follows. 1. The mode of chromosome number in infected HeLa cells was 67 (28%) with the range from 62 to 69, while those in uninfected cells (control) was 68 with the range from 66 to 68. 2. The karyotype analysis of infected cells revealed a decrease in groups B, C and D, and an increase in group A, F and G. 3. Such chromosome aberrations as double minutes and dicentries were observed in infected cells

平 伸明

Karyotype pattern of the cells persistently infected with small plaque variant viruses isolated from ECHO virus type 11 (gregory strain) was studied after several passages of subculture. The results are as follows. 1. The mode of chromosome number in infected HeLa cells was 67 (28%) with the range from 62 to 69, while those in uninfected cells (control) was 68 with the range from 66 to 68. 2. The karyotype analysis of infected cells revealed a decrease in groups B, C and D, and an increase in group A, F and G. 3. Such chromosome aberrations as double minutes and dicentries were observed in infected cells.熱帯医学 Tropical medicine 15(1). p61-67, 1973departmental bulletin pape

平, 伸明

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熱滞医学　第13巻　第1号　61-67頁, 1973年3月 61ECHOウイルス11型の HeLa細胞の染色体に及ぼす形　態　的変　化平伸明長崎大学熱帯医学研究所ウイルス学部門(主任:林　薫教授)(Received for Publication February 10, 1973)Morphological Study on Chromosomesof HeLa CellsInfected with ECHO Virus Type 11.Nobuaki TAlRADepartment of Virology, Institute for Tropical Medicine, Nagasaki University(Director : Prof. Dr. K. Hayashi)AbstractKaryotype pattern of the cells persistently infected with small plaque variant virusesisolated from ECHO virus type 11 (gregory strain) was studied after several passagesof subculture. The results are as follows.1. The mode of chromosome number in infected HeLa cells was 67 (28%) with therange from 62 to 69, while those in uninfected cells (control) was 68 with the range from66 to 68.2. The karyotype analysis of infected cells revealed a decrease in groups B, C and D,and an increase in group A, F and G.3. Such chromosome aberrations as double minutes and dicentries were observed in in-fected cells.緒　　　　　　　　　昌Hamper and Ellison (1961)はchinese hamster胎児由来の,すでに異数化している株化細胞を用い,Herpes simplex virusを感染し細胞変性や分裂抑制現象をみないが,感染細胞の染色体数の変動や染色体の欠失及び切断などの形態異常が認められることを始めて報告した.その後,同様の現象は　Nich℃Is and長崎大学熱帯医学研究所業績　第670号62 平　　　　　伸　　明Levan (1962),Aula (1963) (1965), Kuroki (1966),Aya and Makino (1966)などによつて直接患者材料について観察され,また,培養細胞とウイルレスとの組合せではKopr℃wski (1962), Nichols and Levan(1964), Utsumi 〔1965)などによって観察されている･これらの報告から一般的に言えることは,ウイルス感染の結果認められる染色体異常は,染色体切断,染色体細紛化,乱鉄路形成異常が主な変化である.ウイルスによる染色体の切断は放射線やアルキル化列など化学物療によつて誘発されるものと多少異なり, delayed.　.isolocus chromatidーセype breaks (Ostergren andWak｡nig 1954)とよばれる染色分体レベルの切断はたはGapを主とし,通常切断端の再結合はほとんどみれらないという.実績にMakinoす(1965)は無菌性髄膜炎患者の血液培養で高い比率に染色体異常,特に切断が認められることを報告している.さきに,教室の陳(1971)はECHOウイルス11型標準療であるGregory株に大(Lp),小(Sp) 2種a) plaque変異ウイルL分スが含まれていることを指摘し.次いで　Lp及び　SpウイルスとHeLa細胞の組合せで持続感染系を得て,その模作について若干の解析巷行なった.因みに　ECHO　ウイルス11型は無菌性髄膜炎や発疹症の)原因ウイルスとして知られ乱国でもその流行例が報告されている(多ケ谷).著者はウイルス感染細胞の染色体変化を系統的に追究する目的で実験を行なってシlるが先ず4調は上記の.持綻感染系について染色体の形態変化を観察し,興味ある2, 3の知見を得たので予満としたい.実験材料と実験方法ウイルス:教室の陳(1971)によつて　plaque　純イヒしたS皿all plaque (Sp)変異ウイルスをHeLa制包で継代し,実験のたびに1ar酢plaque (Lp)餐異ウィルスの混在しないことを確かめた.観取及び持続感染系中尉立: 10%年血清及び0.5%ラクトア}L,ブミン如Hanks液で継代したHeLa細胞を使用した･ 150ml容の培養瓶に培養した単層培養分関胞の)培養液の)をすて,燐酸緩衝生理食塩水〔PBS)pH7.4でよく洗候し, Spウイルス(105-5TCD50分0.2ml)2mlを接種した. 37｡C 1時間保った後,維持培地,2チ6仔牛血清加Hanks液を加え, 37℃Cに培養を続けた.約2週間後CPEをまぬがれた細胞を残し,維持液を更新して培養を続けた･約2ケ月後細胞集落をトリプシンで消化し,新めて継代培養した.増殖した細胞を更らに継代し,実験には7ないし10代目のものを使用した･その際の)放出ウイルレスの)値は約1O生.OTCD50分0.2 mlであつた.染色体の検査: Spウイルス持続感染HeLa細胞並びに未感染の対照のD HeLa細胞は10%牛血清及び0. 5%テクトアルブミン加Hanks液で150mlのplaque用培養瓶を用いて37cCで培養した｡培養液10mlにコルヒチン(O.Sr/ml)を注射針で4～5満加えme七aph.aseの状態で細胞分裂を止めた.コルヒチン摘加政3時間目に培養液をすてサ　0.2%のトリプシンン液を加え37℃Cに10分間保温し,続いて瓶をふり細胞をガラス壁から別離した.染色体の検査のための標本作製はMorehead (1960)の変法を用いた.すなわち上記の剥離した細胞浮遊液を遠心菅に移し,遠心分離後上垣液O)ト)ルプシンを除き(U　のクエン酸ソ一ダ液と0名1MKCl溶液を4 1･ 1に混合した液で10分間低張処理を行なつた.これを再度遠心し,上清を捨て,メタル一ルと酢酸を3 : 1に混合したカルレルア液で固定した.遠心分球9よって固定液を2回交換し,細胞をカルノア液に再拝遺して,スライド上に毛細管ピペットで2～4滴おとした後細胞を含む液が一般に拡がった頃をみはからつて,ガスバ一ナ一上で乾燥した･続いて位相差顕微鏡で染色体の拡がり具合を観察しGiemsa液で染色し標本を作製した.染色体の観察:持続感染HeLa細胞並びに素感染の対照　HeL乱　細胞の　metaⅠKhase　をそれぞれ40個及び20個ずつ換鏡し願徴銑写真とした後詳細に分析した･実　　験　　成　　積二先ず束感染の対照HeLa細胞株の染色体数モードは68で　markerとしてB群, G群に1個ずつの)異常巷有していた(Fig-1).染色体数の分布:Table lに示すように束感染対照HeL乱　細胞の染色体数の分布は66-68に集中し68を示す細胞が65%を占めた･一方　ECHOウイルレスECHOウイルL分7ハ11型のHeLa細胞の)染色体に及ぼす形態的変化 63Table 1 Distribution of chromosome numter Tafcle 3　Karyotyping in carrier state出IeLaim七he cells o王carrier state with ECHO virus cells.typ',ellandnon･山n王ectedHeLacells.Chromo-triploid62ー364　向68高69jtotalo壬cells2O4o0　0　1　5 13　06L S住　9 ll 2　1Table 2　Karyotyping in non-infected HeLacells.Remarks : In七he column of number of increaseand decrease, numerator mean thetotal cells e;にamined and denominatormean cells associated with changingthe chromosomes.1234567s910if)1213141516171819202122232423262728293O313233343536373839)401O1212m121OllQ101O1O1O991O12IllIllll9109101091O10101035564ちs43s6s7ちs65336364181816141620182O16212O19182119181818171817181919161619179一　511799981O8871081O9109121297109s99910899in9all998797779781O88Ill01010107791O101OO766876987777877777787777786766679697863767445687777Q℃87Dicentric and acen七rictexaploidnuiin部)erofeaseき2gnumber o壬decrease7777777767ア76三3s主g芸1三喜Remarks : see Table　2.?1Doul)1eminutes646各65646ア63m663E646466as6667673S65676764636365666664 辛Table 4　Summary of variability in number.｡f karyo七ypm琴℃f n℃ninfected and carrier stateHeLa cells with EC!‡O virus type ll.Karyotype (number)HeLa Cellsincreasedecreasecarrier -stateA高BIcID向FーG11型持続感染細胞の)分裂像では, 62-<　と広く分布し67のモード数を示す細胞が28%であつた･また対顔群も持続感染細胞群もそのほとんどが3倍体域に属し6倍体はそれぞれ1個ずつであった.按型分析:非感染HeL乱細胞2D個及びECHOウィルレス11型による持続感染HeLa細胞40偶について観察された染色体の群別とその数をそれぞれTable 2及びTable3に示し,これらをまとめてTable4に掲げた･伸　　明罪感染HeLa細胞20個のうち, 6斂体細胞ユ個が混在していたのでこれを除いた3倍体細胞19個eについて染色体数の増減を各群別毎に調べた結果, A群では8個, E群は15個, F体は14個, G群は10個の細胞にそれぞれ染色体数が増加しているのを認めた.また,B群染色体は被検細胞19個中7個, C群では18個, D群は3個の細胞に染色体数の減少を認めた.それに反してECHOウイルス11型による持続感染細胞40個中に6倍体細胞1個とmu1七iple aberatio皿を示し核型分析が出来なかった細胞1個が含まれていたので,これらを除いた残りの)3各個の)細胞について観察したところ,A群染色体は29個,E群は13個, F群は34個, G群は25個の細胞で染色体数が増加し,.特にE群を除く各群染色体数の増加は非感染細胞の場合より著明であると考えられた･一方, B群は25個, C群は被検全細胞(3.8個) , D群は12個の神性に染色体数甲減少を認め,これは非感染細胞の場合に比べて3群ともその減少の傾向が著しいことが明らかであった.以上の所見から　ECHOウイルレス11型の持鰐感染H^La細胞では, B群, C群, D群染色体の)著明な減少とこれを代償するかのように, A群, F群及びG群の染色体数の増加がみられた･染色体の)形態的変化: Fig. 1, 2, 3,に示すように持続感染細胞群の)5 %に二動原体dicen七ric　と断片のdouble minu七esの染色体異常を見た.Fig 1 marker chromosomes節ECHOウイルス11型のHeLa細胞の染色体に及ぼす形態的変化F強　　dicentric and acentric chromosomes質g 3　d℃�"able mirm七es63考　　　　　　　察著者はウイルス感染における組織培養細胞の染色体変化を系統的に追究したいと考え,先ず,その形態変化に主眼をおいて, ECHOウイルス11型による持続･感染HeLa細胞の場合について観察を行なった.杏実態に使用した持続感染系は1O4･℃ TCD50/Q.雪m1の⊂ ECHO n型ウイルスを放出しているので培養期間中に素感染細肢は放出ウイルスの感染番うけることが考ぇられる･そして細般っによっては1y七ic cycle一を示すことも当然予想されるわけであるが,染色体標轟輝成.に当っては,浮遊細肢はす分シバて洗い去って,ガき,貝更にり充分に固着している細胞だけを剥離して用いる-にとrに努めた｡.本持蹄感染HeLa神性はその分裂娘細胞の6ハ6 平　　　　　伸　　明すべてにECHOウイルス11型のgenomが保持されているかどうかは直接確めているわけではない.このような持続感染細胞を用いて按型の分析を行ない,対照として兼感染の継代HeLa　細胞について同様のことを行なったのであるが,核型分析をすべき被検細胞数を充分に多く(対,臀ン非感染HeLa補包20個及び持続感染細胞40個)観察するとによつて異常の有無を検定することが出来ると考えた.線型分析はDenverの方式に従つて染色体の太さや　cem七romere　の位置によって未感染細胞及び持続感染細胞の核型分析を比敬する一方,染色体数の変動を観察した.既述のように, ECHOウイルス11型による持綜感染HeLa細胞では未感染細胞の照合よりB群,C群及びI)群染色体がそれぞれ減少し,それを代償するかのようにA群, F群及びG群染色体が増加している.しかもこれにはdi仁一entricやdouble minutesの形態変化(Fg, 2, 3)香伴っていることが注目さるべき現象であった. EC王‡Oウイルス11型によるHeLa細胞染色体のこのような異常所見はSaksela等(1965)早,海老名,高橋等(1969)のパラインフルエンザHA2ウイルス感染ヒト胎児細胞やHeLaSS細胞でもG群及びF群の)染色体の)変動という範噂では一致していた.一方Nicholesand Levan等(1962)は麻疹患者, Aurea 〔1963,1965)は水痘,流行性耳下線炎及び麻疹患者, Makino andSasaki (1966)は無菌性髄膜炎症例及びKuroki et al(1舶6)は風疹感染国についてそれぞれ患者の白血球の核型分析を行ない切断像や細粉化像を観察し特に,Nicholes and Leven等(1962)によるとA群C群染色体のあるもの及びE群に二次狭窄部分の切断があるのではないかという一このように,ヒトのウイルス感染の場合,直捷患者の末梢白血球の接型変化を観察した所見は著者の実験例でも観察さたように頻度の差はあるけれどもdicentricやdouble minutesの所見と共通している.しかし,各染色体群内での変動や形態変化は著者の場合を含めて一様でなく,一定の関連を見出すことは今のところ困難である･しかし,今後実験村料としてウイルスや細胞の種頬を増すと共に最近著しく進歩しつつある染色体分析の技法や観察法及び整理法を導入し,ウイルス感染に伴う感染細胞の染色体の形態変化だけでなく生物活性の)変化をも指標とすることによって一定の関連ずけが得られるものと考える.結　　　　　　　　論ECHO　ウイルス11型と　HeLa　細胞の組合せで得られた持続感染細胞の染色体の形態変化を未感染細胞のそれと比較検討した結果次のような所見を得た.(11持続感染細胞の染色体数は未感染細胞のそれより分散度が広いことが判った･(2)持続感染細胞の)染色体はB群, C畔及びD群が減少し,それを代償するかのようにA群, F群, G韓の染色体が増加した.(3)持続感染細胞ではdicen七ri9や断片の) doubleminu七es　の異常を伴っていた.稿を終るに当り,終始ど懇切なるご指導並びにご校閲を賜りました教室主任林教授,並びに種々御助言を賜わりました三舟助教授, AⅠ∋CC鏡石博士に射し,潔甚なる謝意を表すと共に,ご臨力いただいた教室貝各位に深謝を表します･参　　考　　文　　献1) Aula, P. : Cliromosome breaks in leukocytesof ch.icken.pox patients. Preliminary communic-a七iom､ Hereditas 49 : 451―453, 1963..2) Aula, P. : Virus-associated chromos℃mes- breakage.�":�"'Acytbgene七ic study ℃f chickenpox,一皿9瓦sles and mumps patients and o王cell culturesin托cted with measles virus. Ann･ Acad. Sci.二F占an. Series A, w. Biologica 89 : 1-78* 1965-L,分_シ3)廟焼津: ECHOウイルス11型の)性状に関する研究. Ⅰ･ plaque　変異ウイルスについて,熱帯医学,I3 : 45-52, 1971･4)陳境津: ECHOウイルス11型の性状に関する研究.II. Large plaque〔Lp)及びSmall plaqu苧(Sp)変異ウイルスとHeL乱細胞の系における持続盛期について,熱帯医学, 13 :53-60, 1971.5)海老名卓三部,高橋公毅,加茂功,本間守男, :持蹄感染系S3/HA2　に関する研究,特異的染色体変化に伴うアルカリフォスファターゼ活性の低下,第17ECHOウイルス11型のD HeLa ,一関胞の)染色体に及ぼす形素最的変化回日本ウイルL分ス学会総会記録,ウイルL分ス, 1g巻,第5早;74, 1969.6) Ha-per, A. and Ellison S. A. : Nature,192, 145-147, 1961･7) K｡pro'wski,質. Ponthcn, J.且Jensen, F.M｡ohead, P. and Saksela, E. : Trans王orma･七ion of cultures o王human tissue infected withsimian virus SV40･ J. Cell, and Comp. Physiol･59 : 281-292, 1962.8) Kur･ki, Y. :Chromosome abnormalities incultured leukocytes from ruもella patients･ Jap.J. Human Gene七･ ll. : (1) 17一23･ 1966.9) Makino, S. and鮎sak生M･ : Afurtherstudyof chromosomes in cultured leucocytes from.aseptic　甲enigitis patients. Proc. Tap. Acad･42 : 270-274. 1966-10) Mauler, R. and He-?,essere, W. : Virus-wInduced alteration of chromos℃mes. Arch, ges,Virusforsch･ 18 : 175-181. 1965-11) Nicho王s, W. W. Levan, A, Kail, B. an丘･　･ぴsterqren, G･ : Measles-associated chromosomebreakage. Preliminary communication. Here-ditas. 84 : 367-370. 1962-12)Rapp, F. and Hsu, T. C･ : Viruses an且mammalian chromosomes. IV. Replication ofherpes simpleっrこvirus in diploid chienese hamstercells.,virology, 25 : 401-411･ 1965-13)多ケ脊勇.･医学o)あゆみ(WHO report) 52 =369, 1969･　　tー14) Utsu-i, K. R. Kitamura, I.and Treaten,J. T. : Karyological studies of normal ce一山Lsand of adenovirus七ype 12 inducedモロm℃r eel主so王the Syrian hamster名J. Nat. Cancer lnsi.ヨ5 =759-769. 19RR.

ECHOウイルス11型の HeLa細胞の染色体に及ぼす形態的変化

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