Impacto da produção de haloazolisinas na atividade anti-archaea de Haloferax mediterranei

Abstract

Halobacteria, also known as haloarchaea, is a class of halophilic Archaea living in hypersaline environments. Haloarchaea, similarly to all the extremophiles, possess a peculiar metabolism and have developed mechanisms that allow them to survive in harsh conditions, like high salinity, lack of nutrients and excessive UV exposure. Some of these adaptations lead to the production of a unique set of secondary metabolites, such as carotenoids, siderophores, polyhydroxyalkanoates, haloarchaeocins and ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs). RiPPs produced by bacteria have been extensively studied because of their variety of structures and bioactivities, namely, as antibiotics, antivirals, antipain and morphogenetic compounds, but little is known about these peptides in Archaea. Recently, a group of biosynthetic gene clusters (BGCs), putatively encoding the production of RiPPs, were identified in the genome of various haloarchaea using bioinformatics tools and denominated haloazolins. These BGCs encode a cyclodehydratase belonging to the YcaO superfamily that install thiazole and oxazole heterocycles in their cognate peptides and, so far, none of them were experimentally investigated. Haloferax mediterranei ATCC 33500 is a haloarchaea able to inhibit growth of other haloarchaea and which encodes a haloazolisin BGC composed, at least, by the cyclodehydratase (ycaO) and its putative cognate peptide (haloA) genes. The main objective of this work was to investigate if this BGC could be involved in the anti-haloarchaea activity of H. mediterranei. Firstly, we have characterized H. mediterranei growth and the antagonistic activity along five days of growth in YPC agar, and it was concluded that maximum activity was reached after four days of incubation. At this timepoint, the transcriptional levels of ycaO and haloA were determined by RT-qPCR. Both genes were found to be transcribed, although not at the same level. Then, two knockout mutants, H. mediterranei ΔycaO and H. mediterranei ΔhaloA were generated with the pop-in/pop-out method and their antagonistic activity was tested. The deletion of the genes did not influence the production of biomass and ΔycaO and ΔhaloA mutants retained their anti-haloarchaea activity. However, ΔycaO displayed a slightly increased inhibition, whereas ΔhaloA showed a slightly reduced activity compared to the wildtype. Thus, the haloazolisin BGC does not encode the main antimicrobial molecule(s) produced by H. mediterranei, which remains unknown. Additionally, these results suggest that other peptide(s)/protein(s), and not exclusively HaloA, might be a substrate(s) for the YcaO enzyme. Also, they raised some doubts about whether HaloA is the cognate peptide of this enzyme. So, further experimental studies are needed to characterize the antimicrobial molecules produced by H. mediterranei and to understand the cellular function of YcaO and HaloA.Halobacteria, também conhecidas por haloarchaea, é uma classe de Archaea halófilas que habitam ambientes. À semelhança de todos os extremófilos, as haloarchaea desenvolveram mecanismos que lhes permitem sobreviver em condições de elevada salinidade, falta de nutrientes e exposição excessiva aos raios UV. Algumas destas adaptações resultam na produção de um conjunto único de metabolitos secundários, tais como carotenóides, sideróforos, polihidroxialcanoatos, haloarqueocinas e péptidos ribossomais com modificações pós-traducionais (RiPPs). Os RiPPs de bactérias têm sido amplamente investigados devido à sua diversidade estrutural e bioactividades exibidas, tais como, antibióticos, antivirais e compostos morfogenéticos, entre outros. Contudo, pouco se sabe sobre estes péptidos no domínio Archaea. Recentemente, a análise bioinformática genoma de várias haloarchaea revelou a presença de um grupo de clusters biossintéticos (BGCs), designados haloazolinas, que possivelmente codificam para a produção de RiPPs. Nenhum destes BGCs foi investigado experimentalmente, mas todos codificam uma ciclodehydratase pertencente à superfamília YcaO, responsáveis pela instalação de heterociclos de tiazol e oxazol nos péptidos percursores. Haloferax mediterranei ATCC 33500 é uma haloarchaea que inibe outras haloarchaea e possui um BGC de haloazolisina constituído, pelo menos, pelo gene da ciclodehidratase (ycaO) e pelo péptido percursor (haloA). O principal objetivo deste trabalho foi investigar se este BGC está envolvido na actividade anti- haloarchaea de H. mediterranei. O crescimento de H. mediterranei e a sua bioactividade foi caracterizado ao longo de cinco dias em meio YPC agarizado e concluiu-se que a actividade máxima foi atingida após quatro dias. Por RT-qPCR verificou-se que os genes ycaO e haloA são transcritos nesta fase do crescimento, embora em níveis diferentes. Foram obtidos dois mutantes de H. mediterranei (ΔycaO e ΔhaloA) aplicando a técnica popin/pop-out. A eliminação dos genes não influenciou a produção de biomassa e os mutantes mantiveram a sua actividade anti-haloarchaea. Contudo, H. mediterranei ΔycaO mostrou uma inibição ligeiramente aumentada, enquanto que ΔhaloA mostrou uma actividade ligeiramente reduzida quando comparada com a estirpe original. Assim, o BGC estudado não codifica a(s) principal(ais) molécula(s) antimicrobiana(s) produzida(s) por H. mediterranei, que permanecem, assim, desconhecidas. Adicionalmente, estes resultados sugerem que outro(s) peptídeo(s)/proteína(s), e não exclusivamente HaloA, pode(m) ser um substrato para a enzima YcaO. Logo, serão necessários mais estudos para caracterizar as moléculas antimicrobianas produzidas por H. mediterranei, bem como para elucidar a função celular de YcaO e HaloA.Mestrado em Biologia Molecular e Celula