NADPH-Sitokrom P450 redüktaz enziminin sığır karaciğer mikrozomlarından preparatif ölçekte saflaştırılması, antikor elde edilmesi ve enzimin immünolojik, kinetik, biyokatalitik ve diğer fonksiyonel özelliklerinin karakterizasyonu

Abstract

TÜBİTAK TBAG Proje01.07.2009NADPH-cytochrome P450 reductase is an obligatory component of the microsomal cytochrome P450 dependent monoxygenase system where it catalyzes the transfer of reducing equivalents from NADPH to cytochrome P450. The cytochrome P450 reductase, by itself, also plays an important role in the reductive metabolism of some anticancer drugs and antibiotics as well as in lipid peroxidation and production of reactive species that can result in genotoxicity and cytotoxicity. The cytochrome P450 reductase has been purified from small laboratory animals such as the rat, rabbit, guinea-pig and mouse in a biocatalytically active form and characterized. On the other hand, studies related with the characterization of cytochrome P450 reductase and its role in the metabolism of drugs and xenobiotics in veterinary animals like beef have remained limited. In our laboratory, cytochrome P450 reductase was purifed from beef liver tissue in a biocatallytically active amphipathic form for the first time and some biocatalytic and spectral properties were characterized (Arınç and Çelik, 2002; J. Biochem. Mol. Toxicol., 16, 286- 297). However, these studies can be considered as preliminary studies. In this study, immunologic, biocatalytic, kinetic and other funcitonal properties of beef liver reductase were further characterized in detail. The enzyme was purified from beef liver tissue on a preparative-scale and with a higher specific activity by optimizing the previously described method. The specific activity was found as twice of the previous preparation. The molecular weight of the purified enzyme was found to be between 76.000-78.000 dalton as the P450 reductase obtained previously and its absorption spectrum showed the characteristics of flavoproteins. The in vitro effects of detergents Emulgen 913, cholate and Triton X-100 on the activity of beef liver P450 reductase were evaluated using both purified enzyme and microsomes. The results obtained demonstrated that, at various concentrations and mixtures tested, these detergents increased the activity of beef liver P450 reductase between 17% and 40%. These results demonstrated the appropriate concentrations of Emulgen 913 and cholate required for the solubilization of P450 reductase from beef liver microsomes during the purification proceess. The purified enzyme was found to be in biocatalytically active form as shown by its ability to catalyze the benzphetamine Ndemethylation reaction in reconstituted systems containing purified phenobarbital-treated rabbit liver cytochrome P4502B4 and phosphatidylcholine dilauroyl as a synthetic lipid. Since the aminoacid sequence of rabbit liver P4502B is known and it is classified as P4502B4 (Arınc, 1993), this P450 was used in reconstitution studies of benzphetamine Ndemethylation enzyme activity. Stability of cytochrome c reductase activity of the purified 16 enzyme was determined at 37°C in the presence and absence of 20% glycerol and the results obtained were compared with sheep lung P450 reductase. It was shown that glycerol enhanced the stability of both enzyme and beef liver P450 reductase was found to be much more stable compared to sheep lung P450 reductase. The in vitro effects of the metal ions Ni+2, Cd+2 and Pb+2 on the activity of the purified beef liver P450 reductase were elucidated. All the metals ions tested inhibited the activity of the purified enzyme in a noncompetitive manner. Of the metal ions tested, Pb+2 (Ki value: 0.03 mM) was the most potent inhibitor of the purified enzyme, which was followed by cadmium (Ki value: 0.04 mM). Thus, it was demonstrated that lead and cadmium have more serious toxic effects on the purified cytochrome P450 reductase with respect to nickel metal. In this project, policlonal antibodies were produced against beef liver cytochrome P450 reductase for the first time. Thus, an industrial product with many uses in biochemistry, pharmacology, toxicology, pharmaceutical industry and in some biotechnological applications was obtained. The Western-blot experiments using the polyclonal antibodies raised against both purified beef liver P450 reductase and purified sheep lung P450 reductase showed that beef liver and sheep lung P450 reductases are immunologically similar and share common epitopes or antigenic determinants. In this study, it was tried to clarify the action mechanism of anticancer drug idarubicin at the molecular level by using purified beef liver P450 reductase and other purified P450 reductases (sheep lung P450 reductase and phenobarbital-treated rabbit liver P450 reductase). The experiments conducted for this purpose were repeated with mitomycin C, used as a model compound, and the results obtained were compared. It was demonstrated, for the first time, that cytochrome P450 reductase can catalyze the reductive bioactivation of idarubicin with resulting formation of DNA single strand breaks. The mechanism of DNA damage involved the redox cycling of idarubicin with cytochrome P450 reductase under aerobic conditions to generate “reactive oxygen species” (ROS). Thus, the action mechanism of idarubicin at the molecular level was demonstrated for the first time within this study. This pathway with cytochrome P450 reductase was proposed to potentially contribute to the antitumor effect of this anticancer agent. (Çelik and Arınç 2008; J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 11(4), 68-82).NADPH-sitokrom P450 redüktaz sitokrom P450 bağımlı monooksijenaz sisteminin vazgeçilmez bir bileşenidir ve bu sistemde indirgeyici eşdeğerliklerin NADPH’den sitokrom P450’ye transferini katalize eder. Bununla birlikte, sitokrom P450 redüktaz tek başına, bazı antikanser ilaçların, antibiyotiklerin redükleyici metabolizmasında, lipit peroksidasyonunda ve genotoksisite ve sitotoksisite ile sonuçlanan reaktif türlerin oluşumunda da önemli bir rol oynar. Sitokrom P450 redüktaz sıçan, tavşan, kobay ve fare gibi küçük laboratuvar hayvanlarından biyokatalitik aktivitesini koruyarak saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Öte yandan, sitokrom P450 redüktazın sığır gibi besin üreten çiftlik hayvanlarındaki karakterizasyonu ve ilaç ve ksenobiyotik metabolizmasındaki rolü ile ilgili çalışmalar ise sınırlı kalmıştır. Laboratuvarımızda, dünyada ilk kez, sitokrom P450 redüktaz sığır karaciğer dokusundan biyokatalitik olarak aktif, amfipatik yapıda saflaştırılıp, bazı biyokatalitik ve spektral özellikleri karakterize edilmiştir (Arınç ve Çelik, 2002; J. Biochem. Mol. Toxicol., 16, 286- 297). Ancak bu çalışmalar, bir ön çalışma niteliğinde değerlendirilebilir. Bu çalışmada ise sığır karaciğer redüktazın immünolojik, biyokatalitik, kinetik ve diğer birtakım fonksiyonel özellikleri daha ayrıntılı olarak karakterize edildi. Enzim sığır karaciğer dokusundan daha önce tarif edilen metodun optimize edilmesi ile preparatif düzeyde ve daha yüksek bir özgül aktivite ile saflaştırıldı. Özgül aktivitesi, ilk preparatın iki misli olarak saptandı. Saflaştırılmış enzimin moleküler ağırlığı daha önce elde edilenle benzer olarak 76.000-78.000 dalton arasında bulunurken, absorpsiyon spektrumu flavoproteinlerin karakteristik özelliklerini gösterdi. Deterjanlar Emulgen 913, kolat ve Triton X-100’ün sığır karaciğer P450 redüktaz aktivitesi üzerindeki in vitro etkileri hem saf enzim hem de mikrozomlar kullanılarak detaylı olarak incelendi. Elde edilen sonuçlar, bu deterjanların test edilen konsantrasyonlarda ve karışımlarda sığır karaciğer P450 redüktazın aktivitesini %17 ile %40 arasında arttırdığını gösterdi. Bu sonuçlar, saflaştırma işlemi sırasında sitokrom P450 redüktazın sığır karaciğer mikrozomlarından çözünürleştirilmesi için gereken uygun Emulgen 913 ve kolat konsantrasyonlarını göstermiş oldu. Saflaştırılmış enzimin, sentetik lipit fosfatidilkolin dilaurol ve saflaştırılmış fenobarbital muamele edilmiş tavşan karaciğer sitokrom P4502B4’ü içeren yeniden oluşturulmuş sistemlerde ki benzfetamin N-demetilasyon reaksiyonunu katalizleyebildiği gösterilerek biyokatalitik olarak aktif formda olduğu bulundu. Tavşan karaciğer P4502B enziminin amino asit sırası bilindiği ve P4502B4 olarak sınıflandırıldığı için (Arınç, 1993), benzfetamin N-demetilasyon enzim aktivitesini yeniden oluşturma (“reconstitution”) çalışmaları esnasında bu P450 kullanıldı. Saflaştırılmış enzimin sitokrom c redüktaz aktivitesinin stabilitesi 37°C’de %20 gliserol varlığında ve yokluğunda 14 belirlendi ve elde edilen sonuçlar koyun akciğer P450 redüktazı ile mukayese edildi. Gliserolün her iki enzimin de stabilitesini arttırdığı ve sığır karaciğer P450 redüktazın koyun akciğer P450 redüktazına göre çok daha dayanıklı bir enzim olduğu gösterildi. Ni+2, Cd+2 ve Pb+2 metal iyonlarının saflaştırılmış sığır karaciğer P450 redüktaz aktivitesi üzerindeki in vitro etkileri aydınlatıldı. Tüm test edilen metaller saflaştırılmış enzimin aktivitesini yarışmacı olmayan bir biçimde (“noncompetitive”) inhibe etti. Test edilen metaller içerisinde, saflaştırılmış enzimin en güçlü inhibitörü Pb+2 (Ki değeri: 0.03 mM) iken bunu kadmiyum takip etti (Ki değeri: 0.04 mM). Böylece kurşun ve kadmiyumun nikel metaline göre saflaştırılmış sığır karaciğer sitokrom P450 redüktaz enzimi üzerinde çok ciddi toksik etkileri olduğu gösterildi. Proje kapsamında ilk kez olarak sığır karaciğer sitokrom P450 redüktazına karşı poliklonal antikorlar üretildi. Böylece, biyokimya, farmakoloji, toksikoloji ve onkoloji alanlarında, ilaç sanayiinde ve bir takım biyoteknolojik uygulamalarda kullanım alanı mevcut olan olan endüstriyel bir ürün elde edilmiş oldu. Hem saflaştırılmış sığır karaciğer P450 redüktazına hem de saflaştırılmış koyun akciğer P450 redüktazına karşı üretilen poliklonal antikorlar kullanılarak yürütülen Western-blot deneyleri sığır karaciğer ve koyun akciğer sitokrom P450 redüktazların immünolojik olarak benzer olduklarını ve benzer epitopları veya antijenik belirleyicileri paylaştıklarını gösterdi. Bu çalışma kapsamında, saflaştırılmış sığır karaciğer P450 redüktaz ve diğer saflaştırılmış P450 redüktazlar (koyun akciğer P450 redüktazı ve fenobarbital muamele edilmiş tavşan karaciğer P450 redüktazı) kullanılarak antikanser ilaç idarubisinin etki mekanizması moleküler düzeyde aydınlatılmaya çalışıldı. Bu amaçla yürütülen deneyler model bir bileşik olarak kullanılan mitomisin C ile tekrar edildi ve elde edilen sonuçlar mukayese edildi. İlk defa olarak, sitokrom P450 redüktazın, idarubisin’in, DNA tek zincir kırıklarının oluşumu ile sonuçlanan redüktif biyoaktivasyonunu katalize edebileceği gösterildi. DNA hasar mekanizması, idarubisin’in sitokrom P450 redüktaz ile aerobik şartlar altında redoks döngüsüne girerek reaktif oksijen türleri oluşturmasını (“ROS”) gerektirdi. Böylece, idarubisinin moleküler düzeydeki etki mekanizması ilk defa olarak bu çalışma kapsamında aydınlatıldı. Sitokrom P450 redüktaz ile ortaya çıkan bu yol, idarubisinin antitümör etkisine potansiyel olarak katkıda bulanan bir mekanizma olarak öngörüldü (Çelik ve Arınç 2008; J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 11(4), 68-82)