Termofilik mantar Scytalidium thermophilum'un çift aktiviteli katalaz/katekol oksidaz enziminin fenolik maddeler varlığında üretimi ve biyokatalitik özellikleri

Abstract

TÜBİTAK TBAG01.11.2009Scytalidium thermophilum mantar kompostunda yaşayan ve yenebilir mantar Agaricus bisporus’un üretimini tetikleyen bir termofilik mantardır. S. thermophilum’un çok miktarda melanin üretmesinden hareketle, bu küfte fenol oksidaz enzimlerinin varlığının araştırılması hedeflenmiştir. Sonuç olarak, S. thermophilum hücre-dışı fenol oksidazının bir çift aktiviteli katalaz-fenol oksidaz (KATFO/CATPO) olduğu belirlenmiştir. Bu proje kapsamında S. thermophilum 15 farklı fenolik madde varlığında ve farklı dozlarda büyütülmüş ve KATFO’nun üretimi incelenmiştir. Daha sonra, hem ortam sıvısı hem de saf enzim kullanılarak 15 maddenin oksidasyonu incelenmiştir. Saf enzimle okside olabilen ürünlerden 5 tanesinin oksidasyon ürünleri karakterize edilmiştir. Elde edilen bulgulara göre, KATFO sürekli (konstitütif) ve büyümeye paralel olarak üretilmektedir, ancak fenolikler büyümeyi ve enzim üretimini etkileyebilmektedirler. KATFO katekol, hidrokinon, katekin, kuersetin, klorojenik asit ve kafeik asiti okside edebilmiştir. Bunlardan katekol, hidrokinon, kafeik asit, klorojenik asit ve katekinin C-C ve C-O-C bağları ile polimerleştiği görülmüştür. Özellikle dimer, trimer ve tetramer yapıları belirlenmiş ancak, genel olarak, çoklu ürünlerin varlığı ve polimerleşmenin zamana karşı devam ettiği gözlenmiştir. Katekol, hidrokinon, mirisetin, kaempferol ve kumarik asit artan dozlarda büyümeyi olumsuz etkilemiş, kafeik asit, klorojenik asit, kuersetin, katekin, epikatekin, resorsinol, vanillik asit ve resveratrol varlığında ise büyüme olumsuz etkilenmemiş, hatta %50’ye varan artışlar görülmüştür. Büyümeyi olumlu etkileyen fenolikler varlığında KATFO üretimi ya belirgin bir değişim göstermemiş veya artan dozlarda az ya da çok baskılanmıştır. Toksik etkinin görüldüğü durumlarda genelde KATFO’da olumsuz etkilenmiş, ancak antifungal etki gösteren hidrokinon ve mirisetinde KATFO doza bağlı tetiklenmiştir. Büyümeyi olumlu etkileyen fenoliklerin antioksidan etki gösterdiği düşünülmektedir. Bunların çoğu ve özelinde yapısında orto-difenol bulunduran fenolik asitler ve flavonoidler KATFO tarafından okside olabilmiştir. Diğer yandan, antifungal/toksik etki gösteren maddelerin büyük bir kısmı, mirisetin, kaempferol ve kumarik asit, KATFO tarafından okside olmamıştır. Buna göre, KATFO’nun fenolik maddelerin oksidasyonu ile onların toksik etkilerini azalttığı ve/veya antioksidan etkilerini artırdığı yönünde bir olasılık ortaya çıkmıştır.Scytalidium thermophilum is a thermophilic fungus found in mushroom compost, where it triggers the production of the edible mushroom Agaricus bisporus. Since S. thermophilum produces immense amounts of melanin, phenol oxidase production was analysed. As a result, the extracellular phenol oxidase of S. thermophilum was determined as a bifunctional catalase phenol oxidase (CATPO/KATFO). In the scope of this project S. thermophilum was cultivated in the presence of 15 different phenolic compounds, at different concentrations, to explore CATPO production. Next, the oxidation of these 15 substances was analyzed by using both the supernatant and pure enzyme. The oxidation products of 5 of these compounds was further characterized. According to the findings, CATPO is produced constitutively and in a growth-associated manner. Nonetheless, phenolics could affect the growth and enzyme production. CATPO could oxidize catechol, hydroquinone, catechin, quercetin, chlorogenic acid and caffeic acid. These compounds were mainly polymerized by C-C and C-O-C bonds. Especially dimer, trimer and tetramer structures were determined, however, the presence of multiple products and the progression of polymerization by time was also observed. Catechol, hydroquinone, myricetin, kaempferol and coumaric acid have influenced the growth adversely in an increasing concentration manner, on the other hand under the influence of caffeic acid, chlorogenic acid, quercetin, catechin, epicatechin, recorcinol, vanillic acid and resveratrol the growth was not adversely affected, in fact, upto 50% increase in biomass was detected. Most phenolics that positively affected growth either did not change CATPO production or, more or less, repressed it, in a dose-dependent manner. Under toxic conditions CATPO production was adversely affected, however, hydroquinone and myricetin, which showed antifungal acitivity, enhanced CATPO, in a dose-dependent manner. It is suggested that phenolics that affect growth positively show antioxidant activity. Among these, especially the phenolic acids and flavonoids bearing ortho-diphenols in their structures were oxidized by CATPO and did not inhibit growth. However, most phenolics acting in an antifungal/toxic manner, were not oxidized by CATPO. Accordingly, it is suggested that the oxidation of phenolics by CATPO has an affect either on their detoxification and/or enhancing their antioxidant activity