El objetivo de esta comunicación es ofrecer un resumen en castellano del informe sobre cultivo de tejidos de la vid presentado en la Asamblea General de la OIV. Se discute la utilización del cultivo in vitro de la vid en varios proyectos en curso en las áreas de bacteriología, virología y mejora sanitaria en general. Los temas tratados son: a) estudio de la sensibilidad de diversas variedades de vid a Xanthomonas ampelina; b) obtención de plantas libres de viroides; c) mejora sanitaria; y d) micropropagación

Arregui, Juana M.

Durán-Vila, Núria

García-de-Luján, A.

Juárez, José

López, María M.

ReDivia - Repositorio Digital de l'Instit Valencià d'Investigacions Agràries

UTILIZACION DEL CULTIVO IN. VITRO DE LA VID PARA EL ESTUDIODE LAS RELACIONES PATOGENO-HOSPEDADOR(Resumen del informe presentado a la Asamblea General de laOficina Internacional de la Vina y el Vino (OIV))J.M. Arregui A. Garcia de LujanM.M. López Estación ExperimentalJ. Juárez Rancho de la MercedN. Durán-Vila Jerez de la Frontera (Cadiz)Instituto Valenciano de EspanaInvestigaciones Agrarias (IVIA)46113-Moncada (Valencia)EspanaAbstract:We. are presenting a summary of the information reportedat the General Assembly of the OIV on grapevine tissueculture. The utilization of in vitro culture of grapevineson several ongoing researchprojects in bacteriology,virology and sanitary improvement ¡is discussed. Theyinclude: a) studies on the sensibility of several grapevinevarieties to Xanthomonas ampelina, b) production of viroid-free plants; e) sanitary improvement; and a)micropropagation.ResumenEl objetivo de esta comunicación es ofrecer un resumenen castellano del informe sobre cultivo de tejidos de la vidpresentado en la Asamblea General de la OIV. Se discute lautilizacion del cultivo in vitro de la vid en variosproyectos en curso en las areas de bacteriologia, virologiay mejora sanitaria en general. Los temas tratados son: a)estudio de la sensibilidad de diversas variedades de vid aXanthomonas ampelina; hb) obtencion de plantas libres deviroides; C) mejora sanitaria; y d) micropropagacion.1. IntroducciónDesde los inicios del cultivo in vitro de la vid hastahoy se han descrito un gran numero de protocolos condistintos objetivos. Dichos objetivos se han centradosobretodo, en el desarrollo de técnicas que pudieran incidiren la mejora de la calidad de la uva y el vino. Dichastecnicas se han aplicado en proyectos basicos de mejoragenetica, mejora sanitaria, fisiologia, patologia Yconservación de germoplasma. Sin embargo hay que resaltarpor el impacto que han tenido en el sector productivo, laActas del III Congreso, S.E.C.H. 1988459micropropagación (Bass et al., 1981; Silvestroni, 1981) y laobtención de plantas libresde virus (Galzy, 1972, Gifford yHewitt, 1961, Engelbrecht y Schwerdtfeger, 1979).El objetivo de esta presentacion es describir lautilizacion del cultivo in vitro de la vid como técnicaindispensable para el desarrollo de diversas investigacionesque se están efectuando en las áreas de bacteriologia,virologia y mejora sanitaria en general.2. Estudio de la sensibilidad de diversas variedades de vida Xanthomonas ampelinaLa necrosis bacteriana de la vid, causada por labacteria Xanthomonas ampelina, es una enfermedad presente endiversas zonas espanolas (Aragón, Rioja y Galicia) queafecta aproximadamente ¿a mas de 10.000 Ha (Lopez et al.,1977). La ¡importancia de los danos causados por estabacteriosis es muy variable ya que las condicionesclimáticas del ano, determinan en gran medida, la intensidadde los danos. Los métodos de lucha contra la enfermedadse limitan a medidas profilácticas y tratamientos cúpricos,que no son suficientes para controlar la enfermedad en añosfavorables al desarrollo de la misma. Por ello el estudiode la sensibilidad a X. ampelina de distintas variedades devid, es esencial paradeterminar las variedades a utilizaren las zonas donde la enfermedad es endémica. Los ensayosde sensibilidad en campo presentan múltiples inconvenientes:duración y costo de los ensayos, dependencias de condicionesclimáticas, necesidad de establecerlos en zonas infectadas,etc. Asimismo los ensayos en invernadero precisan decostosas instalaciones con elevados gastos de mantenimiento.Las dificultades de realización de los ensayos con plantasde vina en campo o invernadero, han llevado al estudio dedistintos métodos de inoculación de plantas de vidcultivadas in vitro y a comparar la sensibilidad varietal encampo, e invitro.Para laobtencion de plantas in vitro se empleó el metododescrito 'por Silvestroni (1981). “Se ensayaron distintostipos de inoculación de las viñas cultivadas in vitroutilizando suspensiones bacterianas de 10 cel/ml: depositode una gota en plantas no heridas, riego, pulverización delas hojas, inoculación mediante corte del peciolo de unahoja con tijeras que habian sido sumergidas en la suspensiónbacteriana y decapitación con tijeras tambien pasadas porla suspension de inoculo.En las plantas inoculadas por los distintos métodos seobservaron tres tipos de sintomas: proliferaciones, necrosisy chancros. Dependiendo del tipo de inoculación, lavelocidad de aparicion de los sintomas, fué variable,oscilando entre 10-20 dias para la decapitación y 60-120dias para el riego con suspension bacteriana. Se seleccionoel metodo de decapitacion de las plantas por su mayorhomogeneidad y repetibilidad, asl como por la sencillez derealización y la rapidez de aparición de los sintomas.460Se ha aplicado dicho método al estudio de las diferenciasen sensibilidad varietal a 6 variedades cultivadas in vitro,y se han comparado los resultados obtenidoss in vitro conlos de los ensayos de campo (Lopez et al., 1987).Se haconstatado que la intensidad de los sintomas en respuesta adistintas concentraciones bacterianas, y el estado de lasplantas a los tres meses de la incculación, pareció mostrarcorrespondencia entre la sensibilidad en campo e in vitro.Si se confirma la correlación existente entre ambos tiposde inoculación, la tecnica de decapitación de plantacultivada in vitro, podra ser utilizada como un metodoa . —— —o . X=rapido de evaluaci n de la sensibilidad varietal, asi comopara el estudio de distintos aspectos de la relaciónpatogeno-hospedador.Las ventajas de estos tipos de inoculación se deben a laposibilidad de utilizar gran número de plantas homogéneas,sin dependencia estacional ni de parcelas, y en condicionescontroladas, siendo un método rápido y económico quepresenta una elevada seguridad frente ¿a la posiblediseminación de la bacteria.3. Obtención de plantas libres de viroides.Las investigaciones llevadas a cabo en distintos paisesindican que existen varios viroides que se replican en lostejidos de la vid (Flores et al., 1985, Sano et al., 1985 ySemancik et al., 1987). —_ —Una prospección de viroides efectuada en 60 variedadesde vid cultivadas en Espana ha permitido detectar tresviroides distintos (GV-1 GV-2 y GV-3) directamente de lavid cuyo tamano oscila entre 300 y 370 nucleótidos. Medianteinoculaciones de preparaciones obtenidos a partir de tejidosde vid en ginura, se ha identificado otro viroide al queinicialmente se denomino GVs (Flores et al., 1985) y que hasido recientemente caracterizado comouna raza del viroidede la exocortis de los citricos (CEVgv). Se han detectadoGV-1 y GV-2 en 58 de las 60 variedades analizadas, mientrasque GV-2 se encuentra presente en 7 de ellas y GVs solo enla variedad Bobal. No se ha encontrado ninguna variedadlibre de viroides.La enorme difusión de viroides en la vid probablementeobedezca a diversos factores: la propagación vegetativa quepermite la transmisión ya sea a traves del portainjerto o dela variedad, el intercambio indiscriminado de materialvegetal y la transmisión mecanica mediante los instrumentosde poda y recolección.La relación causa-efecto entre estos cuatro viroides ylas enfermedades descritas en vid no es todavia clara. Portanto deben considerarse varias hipotesis alternativas: a)que los viroides sean agentes causales de algunas de lasenfermedades de etiologia desconocida que afectan a la vid;b) que los viroides sean agentes causales de enfermedadestodavia no descritas; c) que los viroides sean componentesde un complejo capaz de inducir una enfermedad; y d) que461sean agentes cripticos o latentes que produzcan solamenterespuestas extremadamente debiles. Sin embargo los estudiosde infectividad y patogenesis se han visto limitados al nodisponer de material libre de viroides. Los programas demejora sanitaria que han servido de base para la obtenciónde material libre de virus, tradicionalmente se han basadoen la selección clonal y sanitaria, y en la utilización detratamientos de termoterapia no son efectivos para laeliminación de viroides (Lizarraga et al., 1980; Stace-Smithy Mellor, 1970).con el fin de continuar las investigaciones esimprescindible disponer de variedades libres de viroides. Seha puesto a punto la tecnica de cultivo in vitro de ápicescaulinares de pequeño tamaño, que sin la aplicación determoterapia permita la obtención de material libre deviroides (Duran-Vila et al., 1988). Actualmente se estaaplicando esta para obtener plantas libres de viroides de 15variedades de vinificacion, 2 variedades de uva de mesa y 8patrones. Una vez iniciado el cultivo debe transcurrir unperiodo, que puede oscilar desde 2 meses para la variedadCabernet Sauvignon a mas de un año para algunos cultivaresde la variedad Palomino, hasta que se observa el desarrollode uno o varios brotes. Estos brotes después detransferidos a medio sin benciladenina, enraizan y puedentrasplantarse a suelo. ,La supervivencia y desarrollo de los apices presentaoscilaciones importantes (30-40% en las variedades SauvignonBlanc y Merlot, hasta 100% en la variedad Zinfandel y lospatrones LN33 y 043-43). Los datos disponibles hasta elmomento indican que la eficacia en la eliminación deviroides tambien varia de unas variedades a otras. El GV2 yGV3 se han eliminado en todos los casos, mientras que el Gvles dificil de eliminar en las variedades Cabernet Franc yChardonnay.4. -Mejora sanitariaPara la mejora del material vegetal de vid esimprescindible tener en cuenta tanto la variabilidadgenética como el estado sanitario del material de partida.Cualquier programa de mejora conlleva la selección de clonescon caracteres agronomicos y de calidad deseables, que debecomplementarse con la calidad sanitaria del materialseleccionado. En un trabajo de seleccion sanitaria dentrode una variedad, no siempre es factible encontrar clonessanos en la población cultivada. Incluso tratándose sólo delas afecciones "court noue", "enroulement" y "marbrure", hayvariedades en las que resulta dificil seleccionar individuossin la presencia de alguno de estos tres agentes patógenostransmisibles por via vegetativa, por lo que es preciso-recurrir a tecnicas especiales de mejora sanitaria.La mayoria de programas de mejora sanitaria de vid sebasan en la aplicación de tratamientos de termoterapia. Sinembargo existe abundante información sobre la eficacia de462las técnicas de cultivo in vitro en la obtención de plantaslibres de virus tanto envid como en otros cultivos, inclusocuando no se utilizan tratamientos de termoterapia(Barlass et al., 1982; Galzy, 1972; Mori y Hosokawa, 1977).Recientemente en Espana se ha iniciado un programa demejora sanitaria de selecciones clonales de vid mejoradaptadas a las condiciones de cultivo de la Comunidadvalenciana. se han utilizado las tecnicas de cultivo deapices caulinares de pequeno tamano. El programa incluye dosvariedades locales de uva de vinificación (Bobal YMonastrell ) y dos variedades de uva de mesa (Mo<catel yRoseti), y tiene como objetivo sanear 2 seleccione. de cadauna de ellas.En 1986 se iniciaron los tests de indexing de las plantasmadre, y en 1987 se efectuaron los primeros cultivos inVitro, En la actualidad se cuenta con plantas procedentesde 21 apices de Bobal, 26 de Monastrell y 29 de Roseti endistintas fases de crecimiento in vitro, y se han iniciadolos primeros trasplantes a suelo.5. MicropropagaciónLa utilización de la micropropagación en vid ha estadofundamentalmente ligada a programas de mejora genética osanitaria que exigian la multiplicación rápida del materialobtenido.El empleo de la micropropagación en nuestro programaviene condicionado, por las necesidades derivadas de losproyectos de investigación en X.ampelina, viroides y mejorasanitaria, y tiene como objetivo la multiplicación rapida delas plantas a emplear.Las técnicas utilizadas son variaciones de las descritaspor otros autores (Silvestroni, 1981). Brotes de alrededorde 0.5-1 cm obtenidos a partir de segmentos nodales o ápicescaulinares se transfieren a medio de micropropagación con 1mg/L de benciladenina con lo que se consigue una nuevaproliferacion de brotes. Cuando es preciso obtener muchasplantas en poco tiempo, se repican tambien segmentos nodaleslo cual permite incrementar mas el numero de cultivosobtenidos en cada repicado. Aunque en teoria esta operaciónse puede repetir indefinidamente, no es aconsejable si sequiere evitar la selección o acumulación de posiblesfenotipos aberrantes. En nuestro caso efectuamos un máximode 8 repicados., "Los brotes asi obtenidos se transfieren a medio sinbenciladenina para su enraizamiento, y una vez enraizados setrasplantan a suelo. Se observan oscilaciones importantesen la velocidad de crecimiento, el indice de proliferación,el enraizamiento y la supervivencia al trasplante.463ReferenciasBarlass, M., Skene, K.G.M., Woodham, R.C. and Krake, L.R.,1982. Regeneration of virus-free grapevines using invitro apical culture. Ann. Appl. Biol. 101, 291-295.Bass, E. and Legin, R. 1981. Thermotherapie etmultiplication in vitro d'apex de vigne: application ala separation oua l'elimination de divers maladies detipe virale et a l'evaluation des degats. Séance, 922-933.Duran-Vila, N., Juarez, J. and Arregui, J.M. 1988.Production of viroid-free grapevines by shoot tip -culture. Am J. Enol. Vit. 39 (3): 217-220,Engelbrecht, C.J. and Schwerdtfeger, U. 1979. In vitrografting of grapevine shoot apices as an aid to therecovery of virus free clones. Phytophylactica 11, 183-185.Flores, R., Duran-Vila, N., Pallás, V. and Semancik, J.S.1985. Detection of viroid and viroid-like RNAs fromgrapevines, J. Gen. Virol. 46, 205-2102.Galzy, KR. 1972: La culture in vitro des apex de Vitisrupestris. C.R. Heb. Acad. Sce. 274, 210-213.Gifford, E.M. and Hewitt, W.B., 1.961. The use heat therapyand in vitro shoot tip culture to eliminate fanleaf virusfrom the grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 12, 129-130.Lizarraga, R.E., Salazar, L.F., Roca, W.M. and Shilde-Rentscheler, L. 1980. Elimination of potato spindletuber viroid by low temperature meristem culture., Phytopathology 70, 754-755.Lopez, M.M., Arregui, J.M. and Navarro, L. 1985. Nuevatecnica de inoculación de Xantomonas ampelina de plantasde vina cultivadas in vitro para el estudio de lasrelaciones huesped/parasito. Proc. II Congreso Nacional, de Fitopatología, 45-50.Lopez, M.M., Gracia, M., Sampayo, M., 1987. Current statusof Xanthomonas ampelina in Spain and susceptibility ofSpanish cultivars to bacterial necrosis. Bulletin OEPP,17, 231-236.Mori, K. and Hosokawa, D., 1977. Localization of viruses inapical meristem and production of virus-free plants bymeans of meristem and tissue culture. Acta Horticulturae78:389-39%6.Sano, T., Uyeda, I., Shikata, E., Meshi, .T., Ohno, T. andOkada, Es 1985. A viroid-like RNA isolated fromgrapevine has high sseqguence homology with hop stuntviroid. J. Gen. Virol. 66, 333-338.Semancik, J.S., Rivera-Bustamante, R. and Goheen, A.C.1987. Widespread occurence of viroid-like RNAs ingrapevines. Am. J. Enol. Vitic. 38 (1), 35-40.Silvestroni, O. 1981. Prime esperienze sullamicropropagazione della vite europea. Vigne vini 8 (10),31-37.Stace-Smith, R. and Mellor, Eso 1970. Eradication ofpotato spindle tuber virus by thermotherapy and axillarybud culture. 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Utilización del cultivo in-vitro de la vid para el estudio de las relaciones patógeno-hospedador

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