Optimización de la regeneración in vitro del olmo utilizando explantes de hoja y evaluación del proceso en experimentos de transformación

Abstract

We set up a regeneration process for the elm hybrid ‘Sapporo’ resistant to Dutch Elm Disease, using leaf discs from in vitro grown plants and tested it in transformation experiments. Two steps were needed : bud induction (3 weeks) followed by bud elongation (4 weeks). Bud meristems initiated near the cut ribs, from several tissues (phloem, procambium, rib upper parenchyma) except epidermis. Regeneration depended on the use of agarose (6 g/l LSM) and diluted MS medium (1/2). The best results (11-14 buds/explant) were obtained in presence of 0.1 μM TDZ and 0.06 μM IAA and when maltose (55-110 mM) or sorbitol (110 mM) were used as carbohydrate sources. During shoot elongation TDZ should be decreased to 0.01 μM or replaced by 1-2 μM BAP and 1.4 μM of GA3 added. At this stage, a mixture of 55 mM sorbitol and 27.5 mM maltose was required. Up to 7 shoots / explant developed and were easily rooted (96%) and acclimatized when sorbitol (27.5 mM) and active charcoal (2 g/l) were added to the rooting medium. Transformation experiments were performed with Agrobacterium tumefaciens disarmed strain GV3101-pMP90 (pKyGUSintron). Regeneration zones exhibited stable GUS expression. However, all shoots grown in vitro died on a selective rooting medium (50 mg/l kanamycin). When attempts for in vitro selection were made (12.5 mg/l kanamycin), some buds were initiated but elongation was prevented. Susceptibility to neomycin seemed very high, therefore, selection markers and selection steps must be revised carefully.Se ha desarrollado un procedimiento para la regeneración del olmo híbrido «Sapporo» resistente a la grafiosis mediante el uso de discos foliares procedentes de plantas cultivadas in vitro y examinadas en ensayos de transformación. Para ello se requirieron dos pasos: inducción de las yemas (3 semanas), seguido de la elongación de las yemas (4 semanas). Los meristemas que dieron origen a las yemas se formaron en la cercanía de las costillas de corte a partir de diversos tejidos (floema, procámbium, parénquima) excepto la epidermis. La regeneración dependió del uso de agarosa (6 g/l LSM) y de medio MS diluido (1/2). Los mejores resultados (11-14 yemas por explante) se obtuvieron en presencia de 0,1 μM de TDZ y 0,06 μM de IAA y cuando la maltosa (55-110 mM) o el sorbitol (110 mM) se usaron como fuente de carbohidratos. Durante la elongación del tallo, el TDZ hubo de ser disminuido a 0,01 μM o sustituido por 1-2 μM de BAP y 1,4 μM de GA3. En esta fase fue necesaria una mezcla de 55 mM de sorbitol y 27,5 mM de maltosa. Se desarrollaron al menos 7 tallos por explante que fácilmente enraizaron (96%) y se aclimataron cuando se añadió sorbitol (27,5 mM) y carbón activo (2 g/l) al medio de enraizamiento. Los ensayos de transformación se desarrollaron con las cepas GV3101-pMP90 (pKyGUSintron) de Agrobacterium tumefaciens. Las zonas de regeneración presentaron una expresión GUS estable. No obstante, todas las yemas cultivadas in vitro murieron en un medio selectivo de enraizamiento (50 mg/l de kanamicina). Cuando se intentó la selección in vitro (12,5 mg/l de kanamicina), algunas yemas se iniciaron pero la elongación fue impedida. La susceptibilidad a la neomicina parece ser muy alta, por lo que los marcadores y los pasos de selección deben ser cuidadosamente revisados