lt was isolated a total of 124 strains marine bacteria. The obtained results gave 70 strains (56.44%) with proteolytic activity. Five strains that presented the best halos to determinative the optimization of kinetic parameters (NaCl, pH and temperature). The genus Pseudomonas presented the best proteolytic activity with extracts of 72 hours. The phenotypic characterization of five strains, were 3 of genus Aeromonas,  one  Pseudomonas  and  one  Alcaligenes.Se aislaron un total de 124 cepas de bacterias marinas. Los resultados obtenidos dieron 70 cepas (56,44%) productoras de proteasas. En cinco cepas que presentaron los mejores halos se optimizaron sus parámetros cinéticos (NaCl, pH y temperatura). La cepa del género Pseudomonas presentó la mejor actividad proteolítica con crudos de 72 h. La caracterización fenotípica de las 05 cepas, tres fueron consideradas como miembros del género Aeromonas, una Pseudomonas y un   Alcaligenes

Arauco  P., Katherine

Galarreta, Hugo

León  Q., Jorge

Sánchez  R., Tito

Woolcott H., Juan Carlos

LAReferencia - Red Federada de Repositorios Institucionales de Publicaciones Científicas Latinoamericanas

56Rev. Per. Quím. Ing. Quím.  Vol. 7  N.º 1, 2004.  Págs. 56-62OPTIMIZACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DEBACTERIAS PROTEOLÍTICAS AISLADAS DE AMBIENTESMARINOS CONTAMINADOSTito Sánchez R.1,3 , Katherine Arauco P.3, Juan Carlos Woolcott  H.2, Jorge León Q1.Hugo Galarreta41 Facultad de Ciencias Biológicas, 2,4 Facultad de Química e Ingeniería Química3 Facultad de Farmacia y Bioquímica - UNMSMRESUMENSe aislaron un total de 124 cepas de bacterias marinas. Los resultados obtenidos dieron  70 cepas(56,44%) productoras de proteasas. En cinco cepas que presentaron los mejores halos se  optimizaronsus parámetros cinéticos (NaCl, pH y temperatura). La cepa del género Pseudomonas presentó la mejoractividad proteolítica con crudos de 72 h. La caracterización fenotípica de las 05 cepas, tres fueronconsideradas como miembros del género Aeromonas, una Pseudomonas y un Alcaligenes.Palabras clave: Bacterias marinas, enzimas extracelulares, proteasas.ABSTRACTIt was isolated a total of 124 strains marine bacteria. The obtained results gave 70 strains (56.44%)with proteolytic activity. Five strains that presented the best halos to determinative the optimization ofkinetic parameters (NaCl, pH and temperature). The genus Pseudomonas presented the best proteolyticactivity with extracts of 72 hours. The phenotypic characterization of five  strains, were 3 of genusAeromonas, one Pseudomonas and one Alcaligenes.Keyboard: Marine bateria, extracellular enzymes, ProteasesINTRODUCCIÓNEn el presente trabajo se aisló y seleccionobacterias marinas  de zonas contaminadascon efluentes pesqueros. Los objetivos fueronaislar y seleccionar bacterias con capacidadde producir proteasas extracelulares deinterés o aplicación biotecnológica, seoptimizaron parámetros cinéticos decrecimiento, para evaluar la actividadenzimática de las cepas más representativasy realizar  su caracterización fenotípica.Los microorganismos marinos psicrótroficos,halotolerantes, poseen  procesosmetabólicos adaptados a bajas temperaturas,realizan sus actividades en condicionesadversas, como altas concentraciones desales, presiones hidrostáticas, pH alcalinos,y condiciones anóxicas, entre otras,produciendo sus enzimas en estascondiciones, con actividades óptimas en unrango de temperatura inferior a la de lasbacterias mesófilos(4).Estos microorganismos marinos con estascaracterísticas pueden ser utilizados en pro-cesos donde sea necesario el trabajo a tem-peraturas ambientales o bajas. Las proteasasson las enzimas más utilizadas en la indus-tria de los detergentes, de alimentos y otrasbebidas, clarificación de cerveza, ablanda-miento de carnes rojas, industria del cuero,entre otras(15).Hoy en día la tecnología enzimática ocupaun papel preponderante dentro de la57Rev. Per. Quím. Ing. Quím.  Vol. 7  N.º 1, 2004.  Págs. 56-62biotecnología y específicamente dentro delsector alimentario y farmacéutico. Alrededordel  65% de las enzimas que se producenindustrialmente están de una u otra manerarelacionadas con la industria alimentaria, aun-que es conveniente señalar que sólo lasproteasas alcalinas empleadas en la indus-tria de detergentes ocupan 25% del total, lasrestantes corresponden a aplicaciones en lasáreas farmacéuticas, industrial y analítica. Unaalternativa para mejorar la eficiencia, reducirlos costos y aumentar la disponibilidad dealgunas enzimas, es el de buscar y seleccio-nar microorganismos con estas capacidadesa partir de ambientes marinos, evaluar susactividades enzimáticas y realizar su carac-terización, así mismo determinar las condi-ciones óptimas de crecimiento de las bacte-rias seleccionadas.MATERIALES Y MÉTODOSMaterial biológicoLas muestras empleadas para el presenteestudio se tomaron del mar en zonascosteras, contaminadas con efluentes de laindustria pesquera (sanguazas), provenientesde fábricas procesadoras de recursoshidrobiológicos de nuestro litoral. Las zonasde muestreo fueron: Bahía de Paracas, Ter-minal Pesquero de Ventanilla, Chancay yChimbote.Recolección de muestrasSe tomaron un total de 30 muestras de aguade mar, en frascos estériles de 250 mL decapacidad a una distancia entre 5 a 50 me-tros de la orilla. Las muestras fueron refrige-radas y transportadas al laboratorio de Mi-crobiología Ambiental y Biotecnología de laFacultad de Ciencias Biológicas de laUNMSM.Procesamiento de  las muestrasLas muestras recoleccionadas fueron proce-sadas en el laboratorio, mediante la técnicade las diluciones seriadas al décimo (10-1,10-2.. 10-5), utilizando  tubos  con  agua de marfiltrada y esterilizada como diluyente. Para elaislamiento y recuento de bacterias marinasse sembraron alícuotas de 0,1 mL de las  di-luciones, por el método de incorporación enAgar Marino (AM) 2216 (Difco), de acuerdo alManual of Method for General and MolecularBacteriology(6, 2) .Selección de cepas proteolíticasPara determinar la capacidad proteolítica delas cepas se tomaron 10 mL de los cultivosde 48 h y se repicaron en Agar Marino suple-mentado con caseína al 1%. Los cultivos fue-ron incubados a 25ºC hasta por 5 días. Lacapacidad hidrolítica de las cepas se recono-cieron mediante la formación de halos trans-parentes alrededor de las colonias, los halosse midieron cada 24 horas  por un periodo de05 días. Las cepas seleccionadas fueron lasque mantuvieron mejor estabilidad y presen-taron los mayores halos en el menor tiempo.Optimización de los parámetros decrecimientoLa optimización de los parámetros cinéticosse realizó en caldo marino (CM) con 5 cepas.Se determinaron los perfiles térmicos (5, 8,15, 25, 37 y 44°C), pH (5, 6, 8, 9 y 10) yconcentraciones crecientes de NaCl (0, 3, 6,9, y 10%).Evaluación de la actividad proteolítica.Para estimular la actividad enzimática de lascepas se sembraron 1 mL de cultivos (106UFC/mL) en frascos con 100 mL de caldomarino (CM) suplementado con caseína al 1%,incubados a 25ºC y agitación constante de120 rpm por 48 horas. La actividad enzimáticafue determinado con los sobrenadantes decrudos obtenidos por centrifugación a 2500rpm, según la metodología recomendada(9, 16).El ensayo se realizó tomando alicuotas de0,2., 0,5 y 1 mL de los sobrenadantes. Seenfrentó a una solución de caseína (Difco) al1%. La mezcla se incubó en baño maría por20 minutos a 25 0C y se detuvo la reacción58con Ácido tricloroacético (ATC), luego decentrifigar a 2500 rpm  se midió su D.O. a280 nm. Se repitió el experimento con las 05cepas utilizando los crudos enzimáticos ob-tenidos de los  cultivos de 24, 48, 72, y 96horas y se determinó la actividad enzimáticacada 24 horas, empleando volúmenes cons-tantes de 0,5 mL.Caracterización fenotípica de las cepasmarinas aisladasLa caracterización fenotípica se realizó me-diante métodos convencionales en tubos yplacas. Como medio base para todas las prue-bas se utilizó el CM o AM según se requiera.La temperatura de incubación se realizó a25°C por 5 días. Las cepas en estudio fueronsometidas a pruebas según procedimientodescritos(1, 10, 12)RESULTADOS  Y DISCUSIÓNAislamiento y selección de cepasSe aislaron un total de 124 cepas de bacte-rias marinas. Las evaluaciones preliminaresdieron 70 cepas (56,44%) productoras deproteasas (Tabla 1). Estos resultados se ase-mejan a los publicados(7) al evaluar la produc-ción de enzimas extracelulares (EEC) en bac-terias aisladas de invertebrados marinos dellitoral peruano, encontró que de un total de102 (100%) cepas con actividadmultienzimática, el 62,74% presentaron acti-vidad proteolítica. Por otro lado otros investi-gadores(3,8), reportan el hallazgo de bacteriasproteolíticas en diversas zonas de las costasdel Japón asociadas a invertebrados marinoscoleccionadas en áreas infralitorales del me-diterráneo respectivamente.En la Tabla 2 se muestran nuestrosresultados de las colonias que produjeronhalos de actividad proteolítica, algunas cepassuperaron los 20 mm de diámetro despuésde las 96 h de incubación. En la Figura 1se evidencia la formación del halo deactividad de la cepa CM48.Tabla 1: Muestreos realizados en  diferenteszonas del litoral peruano para el aislamientode bacterias marinas productoras deproteasasCepas aisladasZonas de MuestreoChancay   (30 - 06 - 00) 4 26 30Chimbote   (13 - 07- 00) 30 18 48Paracas    (20 - 08 -00) 8 6 14Terminal Ventanilla (16 - 10 - 00) 28 4 3270 54 124TotalCepas Cepas no proteoliticasTabla N.º 2. Actividad proteolítica de las cepasseleccionadas en placas de AM suplementadocon caseína.24 48 72 96 120CepasCM43 ± ++ +++ +++ +++CM44 + ++ ++ +++ +++CM45 + ++ +++ +++ +++CM46 + ++ ++ ++ ++CM48 + ++ +++ ++++ ++++(h)T. de incubación++:  Tamaño  aprox. 15 mm Tamaño de los halos formados por las colonias según el tiempo de incubación +++    :  Tamaño aprox. 20 mm++++  :  Tamaño aprox. 25 mm± : Halo alrededor del hoyo+ :  Tamaño  aprox. 10 mm Figura 1: Actividad proteolítica de la cepa CM48en AM suplementado con caseína al 1%. Ob-sérvese el halo transparente alrededor de lacolonia. (cultivo de 96 h).59Determinación de los parámetros óptimosde crecimientoFueron seleccionadas 5 cepas para evaluarsu crecimiento. Los resultados de la evalua-ción frente a diferentes concentraciones deNaCl (0% a 10%) se presentan en la Tabla 3.En ella se observa que la mayoría de las ce-pas crecen en un amplio rango de salinidadincluyendo 0% de NaCl (cepas, CM43, CM44,CM45, y CM46). La presencia de este tipo debacterias ha sido ampliamente estudiado porotros autores, quienes asignan como posi-bles cepas alóctonas que se adaptan a lascondiciones marinas, lo cual es característi-co de bacterias de aguas continentales o deorigen terrestre(14), 3 cepas crecieron en 10%de NaCl (CM43, CM45, CM48), todas  tuvie-ron buen crecimiento en el rango de 3 a 9%de NaCl. La cepa CM48 fue la única que nocreció en ausencia de NaCl, consideradacomo una cepa autóctona del mar. Se  reali-zaron estudios en ambientes marinos encon-trando bacterias proteolíticas halotolerantesa altas concentraciones de NaCl (3-20%), conun crecimiento óptimo a 14% de NaCl(11).Siendo las bacterias dominantes del géneroPseudomonas, Acinetobacter spp y unmenor porcentaje Flavobacterium spp yCaulobacter spp, y Gram positivos comoBacillus y Micrococcus.El perfil de pH (5,0 a 10,0), todas las cepascrecieron en este rango de pH, demostrandosu carácter alcalino. En cuanto al perfil térmi-co ninguna de las cepas creció a 5°C. Cuatrocepas crecieron entre 8 a 44°C, excepto lacepa CM43 que tuvo como temperatura limi-te 37°C. En relación con nuestros resulta-dos(17) aislaron 8 cepas de Pseudomonas debiotopos costeros antárticos, productoras deproteasas con una actividad óptima a 25°C apesar de haber sido aisladas de temperatu-ras bajas. Estas temperaturas de crecimien-to son características de los microorganismosconsiderados como psicrotróficos.Evaluación de la actividad proteolíticaLa evaluación de la actividad proteolítica delas cepas CM43, CM44, CM45, CM46 y CM48Tabla N.º 3: Evaluación de ParámetrosFisicoquimicos de las Cepas con ActividadProteolítica Seleccionadas.Cepas NaCl (%)0 ++ ++ + ++ -3 ++ ++ ++ ++ ++6 ++ ++ ++ ++ ++9 ++ + + + ++10 + - + - +pH: 5.0 + + + + +6.0 ++ ++ ++ ++ ++8.0 ++ ++ ++ ++ ++9.0 ++ ++ ++ ++ ++10.0 + + + + +5 - - - - -8 ++ + ++ + +15 ++ ++ ++ + ++25 ++ ++ ++ ++ ++37 + ++ ++ ++ ++44 - + ++ + ++CM46 CM48CM43 CM44 CM45Parámetros -  :   No crecimiento+ :   Crecimiento tenue++ :   Buen crecimientoTemp. (ºC):mostró que la cepa CM48 del géneroPseudomonas fue la que presentó mayor ac-tividad, con los diferentes volúmenes de loscrudos enzimáticos utilizados (0,2., 0,5 y 1mL), dando actividades enzimáticas de 1.22,2.48 y 3.0 U respectivamente por cada volu-men utilizado. Asimismo en la evaluaciónposterior con un volumen constante (0,5 mL),tomados de cultivos de diferentes tiempos (24,48, 72 y 96 h), las actividades enzimáticasmás altas correspondieron igualmente la cepaCM48, con valores de 4.95 U con un cultivode 72 h,  y de 5.36 U con un cultivo de 96horas (Tabla 4 y Figura 2), También encontra-ron valores similares(18) de actividad proteolíticade 33,65 U/mL, aunque dichos autores em-plearon una cepa de Flavobacteriumindolegenes cultivadas en medio Horikoshi(inductor de proteasas) en agitación constantede 200 rpm y 30°C de incubación, durante 72horas. Otros investigadores(17) reportan la ac-tividad proteolítica de 8 cepas dePseudomonas aisladas de biotopos costerosantárticos. Las proteasas mostraron activida-des de 1700 U/L a 1x105 U/L en extractos decultivos de 48 a 72 h, a 20°C.60La evaluación de la actividad proteolítica decrudos enzimáticos mediante la formación dehalos en levaduras marinas pertenecientes alos géneros Pichia y Debaryomyces en me-dio papa dextrosa suplementado con caseí-na al 1%  e incubados a temperatura ambien-te por 4 días(13) mostraron halos de 4 a 11mm de diámetro. Estos valores, a pesar queen nuestro caso no se trabajó con levaduras,son de alguna manera comparables a los halospresentados por nuestras cepas luego de 4días de incubación en medio AM suplemen-tado con caseína al 1%, siendo la cepa CM48una Pseudomonas sp la que mostró mayoractividad, con un diámetro superior a 20 mmde diámetro a las 96 horas de incubación a25°C y a un pH de 8 (Tabla 2). La actividadproteolítica de 05 cepas marinas (CM43,CM44, CM45, CM46 Y CM48) comparadascon otros trabajos mencionados resultan serinteresantes para continuar los estudios rela-cionados a mejorar las condiciones de creci-miento y producción de enzimas proteolíticasextracelulares en microorganismos marinos.El mayor valor de D.O obtenido de 1.073correspondio a la cepa CM48 con un cultivode 96 h, equivalente a una actividadenzimática de 5.365 U.Caracterización fenotípicaLa caracterización fenotípica de 11 cepasseleccionadas se muestra en la Tabla 5. DeTabla  4: Actividad proteolítica de los extractos (0,5 ml) de 05 cepas, en cultivos de diferentestiempos (h) y 1,0 ml  de sustrato caseína al 1%Actividad  enzimática (U) a diferentes tiempos (h)CEPAS 24 48 72 96CM43 1.5214 2.1252 3.3656 3.4070CM44 1.7758 1.9993 2.2467 2.2456CM45 1.0285 1.5130 3.3256 3.3010CM46 1.2117 1.3245 2.0801 2.0608CM48 2.1239 3.009 4.9551 5.1850Tabla 5: Caracterización fenotípica de 5 cepas proteolíticas seleccionadas.CepasCaracterística CM 43 CM 44 CM 45 CM 46 CM 48Morfología  Gram B(-) B(-) CB(-) B(-) B(-)Motilidad + + + + +Disp.  flagelar Mon Mon Per Mon PolIndol - + + + -H2S - - + - -Luminiscencia - - - - -Catalasa  + + + + -Oxidasa  + + - + +Enz.s Extrac:DNAsa  + + - + -Celulasa  - - - - -Amilasas + - + - -Caseinasa + + + + +Lipasas + + + + +O/F(glucosa):   Ks/F Ks/F KsO/F Ks/F KsOB :   Bacilos         CB  :   Cocobacilos   per.   :   Peritricos  G(+)  :   Gram. Positivo       O    : Oxidativo      F   :   Fermentativo +  : Positivo         -   :   Negativo       K     :  Alcalino Ks   :   Superficie alcalina    Pol : Polar        Mon  :    Monotricos 61012345624 48 72 96Ti empo e n  ( h)CM43 CM44 CM45 CM46 CM48Figura N.º 2.  Actividades proteolíticas de los cru-dos enzimáticos (0,5 mL) de cinco cepas toma-dos de cultivos de diferentes tiempos deincubación en 1,0  mL de caseína al 1%.BIBLIOGRAFÍA[1] BAUMANN, L., Baumann, M., Mandel M.&  Allen, R. Taxonomy of aerobic marineeubacteria J. Bacteriol 110: 402 - 429.1972.[2] BERGEYS Manual of determinativebacteriology 9° Edition. BaltimoreMaryland. 1994.[3] DUONG, V. Occurrence and genericcomposition of protease  Producingmoderately hemophilic bacteria in neriticseawater around Japan. Bulletin of theJapanese Society of Scientific Fisheries-Japan. 1981.[4] FELLER, G., Narinx, E., Arpingny, J.,Haleb, M., Baise E., Genicot S., Gerday,Ch. Enzymes from psychrophilicorganisms. FEMS Microbiol. 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Sealis . 29: 795-798. 1981.acuerdo a la caracterización fenotípica, las05 cepas fueron Gram negativas, pertenecien-tes a los siguientes géneros: Aeromonas lascepas CM43, CM44 y CM46, Pseudomonasla cepa CM48 y  Alcaligenes  la cepa CM45.CONCLUSIONESDe un total de 124 (100%) cepas marinas ais-ladas, las bacterias con capacidad de produ-cir enzimas proteolíticas fueron 70 (56,44%),las cuales a su vez guardan relación directacon los substratos disponibles en las zonascontaminadas con efluentes pesqueros(sanguazas).Las bacterias marinas productoras deproteasas y otras exoenzimas, poseen altasactividades a bajas temperaturas, ideales paraser utilizadas en la tecnología de detergentesy en la industria de alimentos también ofre-cen alternativas en la prevención, control ybiorremediación de ambientes marinos con-taminados con efluentes orgánicos.  Los re-sultados mostraron que la cepa con mayoractividad proteolítica es la CM48 pertenecienteal género Pseudomonas, considerada comoautóctona de ambientes marinos por creceróptimamente en pH alcalino y necesitar parasu crecimiento NaCl. La mayoría de las ce-pas evaluadas  resultaron ser psicrotróficas,halotolerantes (3 al 9% de NaCl) y de creci-miento a pH alcalino.62[11] ONISHI, H., Mac Cane, M. & Gibbons, E.Can. Journal Micro. 11: 365 - 373.1965.[12] ORTIGOSA, M. Garay, E., & Pujalte, M-J. Numerical taxonomy of aerobic, Gram negative bacteria associated withoysters and surrounding seawater of theMediterranean coast.  Appl. Microbiol.17:589 - 600. 1994.[13] RAMÍREZ, O., Hernández, N y Ochoa,J. Aprovechamiento biotecnológico delevaduras marinas. IV CongresoLatinoamericano de Biotecnología yBioingeniería. P. III. 68. México. 1999.[14] RONALD, M., Bartha, R. Ecologíamicrobiana y microbiología ambiental,4ta. Edición. Edit. Pearson Educación,S.A. Madrid-España.  1998.[15] SCHMIDT H. 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