Survival of vitrified mouse blastocysts loaded into glass micro-capillaries¤ Sobrevivencia embrionaria de blastocistos murinos vitrificados en microcapilares de vidrio Sobrevivência embrionária de blastocistos murinos vitrificados em micro capilares de vidro

Abstract

The purpose of this study was to determine the in vitro expansion and hatching rates of vitrified mouse blastocysts loaded into glass micro-capillaries (Brand® - 5 &mu;L). Early morning on day 4 of pregnancy, blastocysts were collected from donors, morphologically evaluated, and then allocated in three groups: Group 1 (Control): embryos were transferred into 100 &mu;L of KSOM medium drops and in vitro cultured during 72 h; Groups 2 and 3: embryos initially exposed to the equilibration solution (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) for 1 min, and then to vitrification solution (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) for 30 sec. After that, blastocysts were loaded into glass micropipettes (GMP) or glass microcapillaries (GMC) and plunged into super-cooled liquid nitrogen (-200 &deg;C). Embryo warming and cryoprotectant dilution were carried out into 500 &mu;L droplets of PBSm supplemented with 0.25 M sucrose maintained at 37 &deg;C. After 5 min embryos were transferred to 100 mL droplets of KSOM medium and cultured in vitro for 72 h. Blastocyst expansion rates after in vitro culture were 77% (138/177) and 74% (131/175), for blastocysts vitrified in GMP and GMC, respectively. Blastocyst hatching rate (control group) was 91% (134/146), which was higher than for embryos loaded in GMP 61% (108/177) and GMC 53% (93/175). ICM number in control group embryos contained 25.7 &plusmn; 2.5 cells and did not differ from the mean cell number observed in vitrified embryos loaded in GMP (24.2&plusmn;2.3) or GMC (22.5&plusmn;2.59). Regarding the trophoectoderm cell number, Group 1 embryos displayed 63.1&plusmn;3.0 cells, and also not differ from the cell numbers of the embryos loaded into GMP (58.0&plusmn;1.8) or GMC (58.0&plusmn;.3.7). In conclusion, manufactured GMC (Brand®) tested in this study showed same efficiency as GMP for vitrification of mouse blastocysts.<br>El objetivo de este estudio fue determinar las tazas de expansión y eclosión in vitro de los blastocistos murinos vitrificados en micro-capilares de vidrio (Brand® - 5 &mu;L). En el día 4 de preñez, los blastocistos eran colectados de las donantes, evaluados morfológicamente y localizados en tres diferentes grupos: Grupo 1 (Control): compuesto por los embriones que eran transferidos a gotas de 100 &mu;L de medio KSOM y cultivados in vitro por un periodo de 72 h; Grupos 2 y 3: compuesto por los embriones que eran expuestos inicialmente a la solución de equilibrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) por 1 min, y posteriormente a la solución de vitrificación (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por un periodo de 30 seg. Posteriormente, los blastocistos, eran almacenados dentro de micro-pipetas de vidrio (GMP) o micro-capilares de vidrio (GMC) y sumergidos en nitrógeno líquido (-200 &deg;C). La dilución de los crioprotectores y desvitrificación de los embriones fue realizada al colocarlos en gotas de 500 &mu;L de PBSm suplementado con 0.25 M de sacarosa a una temperatura de 37 &deg;C. Después de 5 minutos los embriones fueron transferidos a gotas de 100 &mu;L de medio KSOM y cultivados in vitro por 72 h. Las tazas de expansión de los blastocistos, posteriores al cultivo fueron de 77% (138/177) y 74% (131/175), para los blastocistos vitrificados en GMP y GMC, respectivamente. Las tazas de eclosión fueron de 91% (134/146) para el grupo control, siendo mayores que para los embriones vitrificados en GMP 61% (108/177) y GMC 53% (93/175). El número del índice de masa celular interna (ICM) para los embriones del grupo control fue de 25.7 &plusmn; 2.5 células, no teniendo diferencia significativa con el número de células observado en los embriones vitrificados en GMP (24.2&plusmn;2.3) ó GMC (22.5&plusmn;2.59). Además, las células del trofoectodermo, en el grupo control presentaron 63.1&plusmn;3.0 células, no siendo tampoco diferentes de las células de los embriones vitrificados en GMP (58.0&plusmn;1.8) ó GMC (58.0&plusmn;.3.7). En conclusión, las GMC comerciales (Brand®) probadas en este estudio muestran la misma eficiencia que las GMP para la vitrificación de embriones murinos.<br>O objectivo de este estudo foi determinar as taxas de expansão e eclosão in vitro dos blastocitos murinos vitrificados em micro capilares de vidro (Brand® - 5 &mu;L). No quarto dia de prenhes, os blastocitos foram colectados das doadoras, avaliados morfologicamente e localizados em três diferentes grupos: Grupo 1 (Controle): composto por os embriões que foram transferidos a gotas de 100 &mu;L de KSOM e cultivados in vitro por um período de 72 h; Grupos 2 e 3: composto por os embriões que foram expostos inicialmente á solução de equilíbrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH e 0.5% PVA) por 1 min, e posteriormente á solução de vitrificação (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por um período de 30 seg. Posteriormente, os blastocistos, foram armazenados dentro de micro pipetas de vidro (GMP) ou micro capilares de vidro (GMC) e submergidos em nitrogénio líquido super-resfriado (-200&deg;C). A diluição dos crioprotetores e desvitrificação dos embriões foi realizada ao colocar-lhos em gotas de 500 &mu;L de PBSm suplementado com 0.25 M de sacarose a uma temperatura de 37 &deg;C. Depois de 5 minutos, os embriões foram transferidos a gotas de 100 &mu;L de KSOM e cultivados in vitro por 72 h. As taxas de expansão dos blastocistos, posteriores ao cultivo foram de 77% (138/177) e 74% (131/175), para os blastocistos vitrificados em GMP e GMC, respectivamente. As taxas de eclosão foram de 91% (134/146) para o grupo controle, e foram maiores os embriões vitrificados em GMP 61% (108/177) e GMC 53% (93/175). O número do índice de massa celular interna (ICM) para os embriões do grupo controle foi de 25.7 &plusmn; 2.5 células, não havendo diferencia significativa com o número de células observado em embriões vitrificados em GMP (24.2&plusmn;2.3) ou GMC (22.5&plusmn;2.59). Alem do mais, as células do trofoectodermo, no grupo controle apresentaram 63.1&plusmn;3.0 células, no sendo diferente às células dos embriões vitrificados em GMP (58.0&plusmn;1.8) ou GMC (58.0&plusmn;.3.7). Em conclusão, as GMC comerciais (Brand®) provadas neste estudo indicam a mesma eficiência que as GMP para a vitrificação de embriões murinos