The article describes a method for producing a peptide extract of a bird's Fabrician bag and presents the results of using this extract on human lung embryo cell cultures (HLE-3-81).В статье рассмотрен способ получения пептидного экстракта фабрициевой сумки птиц и приведены результаты использования данного экстракта на культурах клеток легкого эмбриона человека (ЛЭЧ-3-81)

Makeev, O. G.

Shcheglova, A. V.

Sichkar, D. A.

Yakovleva, E. A.

Макеев, О. Г.

Сичкар, Д. А.

Щеглова, А. В.

Яковлева, Е. А.

Ural State Medical University Repository

V Международная (75 Всероссийская) научно-практическая конференция  «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения»  309  УДК 615.038  Щеглова А.В., Яковлева Е.А., Сичкар Д.А., Макеев О.Г. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТОВ ПЕПТИДНЫХ ЭКСТРАКТОВ ФАБРИЦИЕВОЙ СУМКИ ПТИЦ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК Кафедра медицинской биологии и генетики Уральский государственный медицинский университет Отдел молекулярных и клеточных технологий и радиоизотопная лаборатория ЦНИЛ ГАУЗ СО Институт медицинских клеточных технологий Екатеринбург, Российская Федерация  Shcheglova A.V., Yakovleva E.A., Sichkar D.A., Makeev O.G. RESEARCH OF EFFECTS OF PEPTIDE EXTRACTS OF BIRDS FABRICIAN BAG ON CELL PROLIFERATION Department of Medical Biology and Genetics Ural State Medical University Department of Molecular and Cell Technologies and Radioisotope Laboratory Institute of Medical Cell Technologies Yekaterinburg, Russian Federation  E-mail: larim@mail.ru  Аннотация. В статье рассмотрен способ получения пептидного экстракта фабрициевой сумки птиц и приведены результаты использования данного экстракта на культурах клеток легкого эмбриона человека (ЛЭЧ-3-81). Annotation. The article describes a method for producing a peptide extract of a bird's Fabrician bag and presents the results of using this extract on human lung embryo cell cultures (HLE-3-81). Ключевые слова: фабрициева сумка, клеточная пролиферация, культура клеток ЛЭЧ-3-81. Key words: Fabrician bag, cell proliferation, cell culture HLE-3-81.  Введение На фармацевтических рынках представлен ряд препаратов, получаемых из животных тканей. Из последних получают вытяжки (пептидные экстракты), а из них - синтетические вещества (цитокины), используемые для создания различных вакцин и биологически активных добавок. Разработки в данном направлении продолжаются и на сегодняшний день. Цель исследования – оценить влияние экстракта, полученного из фабрициевой сумки птиц, на пролиферативные способности клеток культуры ЛЭЧ-3-81. Материалы и методы исследования V Международная (75 Всероссийская) научно-практическая конференция  «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения»  310  Экстракт был получен из фабрициевой сумки (в дальнейшем – бурса), иссеченной из сырья (молодые цыплята-бройлеры). Извлеченную бурсу отмывали попеременно в растворах хлоргексидина и в физиологическом растворе (0,9 % раствор хлорида натрия). Затем измельченную скальпелем бурсу инкубировали в холодильной камере (при t=+4о С). После окончания времени инкубации из раствора механически удалялись крупные частицы бурсы. Раствор центрифугировали 30 минут при 800g и температуре 0°C, осадок утилизировали, супернатант отделяли автоматической пипеткой и помещали в стерильные флаконы. Раствор фильтровали с помощью фильтрационной установки под отрицательным давлением и с диаметром пор 0,22 мкм. Клеточную культуру ЛЭЧ-3-81 в культуральных флаконах помещали в CO2-инкубатор, где хранили при 5% СО2, t=37°C и 95% влажности в течение суток. По истечению суток флаконы извлекали из СО2-инкубатора. Переводили клетки из монослоя в суспензию и переносили в центрифужную пробирку. Центрифугировали в течение 5 минут при 200g. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 2 мл полной питательной среды и проводили подсчет клеток в камере Горяева. Затем проводили посев клеток в 96-луночный планшет в количестве 100 мкл клеточной суспензии на лунку (104 клеток в каждой лунке) и помещали  планшет в CO2-инкубатор. После 24 часов культивирования к культуре клеток ЛЭЧ-3-81 методом раститровки добавляли различные концентрации пептидного экстракта. В верхние три лунки каждого ряда добавлялась смесь клеток с определенной концентрацией препарата, а в нижние три лунки добавлялась смесь клеток с физиологическим раствором (0,9% раствор хлорида натрия). Каждую концентрацию препарата выполняли в восьми повторностях. В контрольные лунки препарат не добавляли. Планшет с внесенным экстрактом помещался в СО2-инкубатор на 24 часа. После 24 часов культивирования клеточной линии ЛЭЧ-3-81 с исследуемым экстрактом в каждую лунку культурального планшета вносили по 20 мкл рабочего раствора МТТ. Инкубировали еще 4 часа в условиях СО2-инкубатора. Через 4 часа среду в каждой лунке заменяли на лизирующий раствор (DMSO/изопропиловый спирт в соотношении 1:1). Тщательно пипетировали содержимое каждой лунки планшета до растворения кристаллов формазана. С помощью вертикального планшетного спектрофотометра MultiskanGo (ThermoScientific, Финляндия) определяли оптическую плотность каждой лунки при 570 нм, вычитали измеренное фоновое поглощение при 690 нм. Значение концентрации, вызывающее 50% ингибирование роста популяции клеток (OD50), определяли на основе дозозависимых кривых. Жизнеспособность клеток ЛЭЧ-3-81 в присутствии пептидного экстракта рассчитывается по формуле: (ОП опытных лунок – ОП среды) / (ОП контр.лунок – ОП среды) × 100%, где ОП — оптическая плотность. При этом ОП не должна превышать 0,05 ед. (по шкале 0,0–1,0). Стандартное отклонение V Международная (75 Всероссийская) научно-практическая конференция  «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения»  311  рассчитывается по формуле: √∑(𝑥−?̅?)2(𝑛−1), где x – выборочное среднее значение (число1, число2, …), n — размер выборки. Концентрация вещества, которая вызывает 50% гибель клеток (OD50), рассчитывается графически по дозозависимой кривой с помощью программного обеспечения R-Studio (R-ToolsTechnology). Значение функции рассчитывается по формуле:𝑦 = 𝐴1 + 𝐴2−𝐴11+10log𝑥 0−𝑥)𝑝, а значение OD50 по формуле: 𝐸𝐶50 =  10log𝑥 0. Результаты исследования и их обсуждение Динамические изменения интенсивности образования кристаллов формазана в культуре клеток линии ЛЭЧ-3-81 свидетельствуют о повышении ферментативной активности  клеток (повышение синтеза митохондриальных оксидоредуктаз), что косвенно указывает на повышение пролиферативной активности клеток. Максимальные значения наблюдались при добавлении препарата в концентрации 25%. Добавление препарата в минимальной концентрации (0,195%) незначительно повысило ферментативную активность клеточной культуры. Полная замена культуральной среды на исследуемый экстракт не привела к гибели клеток, однако снизила синтез внутриклеточных ферментов по сравнению с группой контроля. В результате эксперимента было установлено, что исследуемый образец не обладает цитотоксическим эффектом. Результаты исследования представлены на рисунке 1. Рис. 1. График дозозависимой кривой экстракта из бурсы в отношении культуры клеток ЛЭЧ-3-81.  Доверительный интервал +/- Cl-95%. Также в процессе исследования пептидного экстракта были определены условия его хранения. По результатам исследований, хранение раствора при температуре -20оС (и более) оптимально, так как такая температура позволяет V Международная (75 Всероссийская) научно-практическая конференция  «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения»  312  сохранить полезные свойства препарата. Хранение экстракта  при температуре +4оС приводит к образованию осадка и помутнению раствора, в результате чего для дальнейшего его применения требуется дополнительная фильтрация в стерильных условиях. Однако, на полезные свойства опытного образца это не влияет – результаты МТТ–теста незначительно отличались от результатов исследований того же раствора с условиями хранения -20о С. Результаты исследования представлены на рисунке 2.  Рис. 2. Сравнительная характеристика влияния пептидного экстракта на пролиферативную активность культуры клеток ЛЭЧ-3-81. Группа К1 – хранение при -20оС (и более); группа К2 – хранение при +4о С. Доверительный интервал +/- Cl-95% Выводы: 1.Пептидный экстракт из фабрициевой сумки птиц не обладает цитотоксическим эффектом в отношении культуры клеток ЛЭЧ-3-81. 2.Рекомендуемые условия хранения данного опытного образца для сохранения полезных свойств – при температуре -20°C и более. 3.Хранение при температуре +4°C (в условиях обычной холодильной камеры) приводит к образованию осадка и помутнению раствора, что вынуждает проводить дополнительную фильтрацию. Однако на полезные свойства экстракта это не влияет. Список литературы: 1. Gianoli A. C. Revitalisationstherapie in Klinik und Praxis //Z. praeklin. Geriatrie. – 2015. – Т. 5. – С. 186-192 2. Hagmeier W. et al. Successful treatment of cancer patients using immunotherapy with lyophilisate of the fetal mesenchyme // Cytobiol. Rev. - 2016. - T. 3. - S. 10-14 3. Renner H. Clinical aspects of tumor immunotherapy with liophilized fetal cells // Cytobiol. Rev. - 2018. - Т.3. - С.3-6 

Research of effects of peptide extracts of birds fabrician bag on cell proliferation

http://elib.usma.ru/bitstream/usma/3094/1/USMU_Sbornik_statei_2020_2_074.pdf

Research of effects of peptide extracts of birds fabrician bag on cell proliferation

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Ural State Medical University Repository