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Previous issue date: 2019CNPq, FAPEMIG e Programa de Excelência em Pesquisa (PROEP) do IRR/FIOCRUZ, CAPESFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.Em áreas endêmicas para malária, o diagnóstico molecular de infecções por Plasmodium tem identificado altas frequências de infecções de baixa densidade, abaixo do limite de detecção da microscopia convencional. Muitas são as implicações destes achados, já que os portadores de malária submicroscópica podem transmitir os parasitos, atuando como reservatórios da doença. Historicamente, a maioria dos protocolos de PCR para malária se baseia na amplificação das poucas cópias do gene 18S rRNA, que apresenta baixa sensibilidade e reprodutibilidade. Na última década, a mineração de dados genômicos dos parasitos do gênero Plasmodium permitiu a descoberta de novos alvos espécie-específicos múlticópias – tais como Pvr47 em P. vivax e Pfr364 em P. falciparum – promissores para o diagnóstico molecular da malária. Neste trabalho,
nós desenvolvemos um protocolo de PCR em tempo real não ribossomal (NR-qPCR) para amplificar os alvos Pvr47/Pfr364. A NR-qPCR foi comparada a três protocolos de PCR bem estabelecidos, dois deles baseados no gene 18S rRNA (Nested-PCR e R-qPCR) e um terceiro, o ensaio de PCR original que possui como alvos Pvr47/Pfr364 (NR-cPCR). Curvas de titulação de infecções mistas artificiais por P. vivax e P. falciparum demonstraram um aumento de sensibilidade da NR-qPCR em
comparação com os outros ensaios de PCR, mesmo quando o DNA de uma das espécies esteve presente em uma proporção cem vezes menor do que da outra espécie. A avaliação dos quatro ensaios de PCR em amostras de campo, incluindo indivíduos sintomáticos ou assintomáticos, confirmou que as infecções maláricas submicroscópicas não foram prevalentes entre os pacientes sintomáticos, mas representaram uma grande proporção (até 77%) entre os indivíduos assintomáticos, expostos à malária na Amazônia. De relevância, a amplificação de diferentes alvos
plasmodiais (Pvr47/Pfr364 e gene 18S rRNA) não aumentou a chance de detecção de infecções maláricas submicroscópicas. Como a maioria das infecções subclínicas foi causada por P. vivax, a forma mais comum de malária na floresta amazônica, futuros estudos devem investigar o potencial de Pvr47/Pfr364 para detectar infecções de malária mista em campo.In malaria endemic areas, the molecular diagnosis of Plasmodium infections has identified high frequencies of low-density infections, beneath the limit of detection of the conventional microscopy. Many are the implications of these findings as submicroscopic malaria carriers may be able to transmit the parasites, acting as reservoirs of the disease. Historically, most malaria PCR-based protocols rely on amplification of the few copies 18S rRNA gene, which presents low sensitivity and
reproducibility. In the last decade, the genomic data mining of Plasmodium parasites allowed the discovery of new species-specific multi-copy targets – such as Pvr47 for P. vivax and Pfr364 for P. falciparum – which seem promising for malaria molecular diagnosis. Here, we developed a non-ribosomal real-time PCR protocol (NR-qPCR) to amplify the Pvr47/Pfr364 targets. The NR-qPCR was compared with three wellestablished PCR protocols, two of them based on the 18S rRNA gene (Nested-PCR
and R-qPCR) and the third one, the original PCR assay targeting Pvr47/Pfr364 (NRcPCR). End-point titration curves of artificial mixed P. vivax and P. falciparum infections demonstrated an increase sensitivity of NR-qPCR as compared with the other PCR assays, even when the DNA of one of the species was present in a ratio of hundred-times lower than of the other species. Evaluation of the four PCR assays in field samples, including from individuals symptomatic or asymptomatic, confirmed that submicroscopic malaria infections were not prevalent among symptomatic
patients, but represented a large proportion (up to 77%) among asymptomatic Amazonian malaria-exposed individuals. Of relevance, the amplification of different plasmodial targets (Pvr47/Pfr364 and 18S rRNA gene) did not increase the chances of detecting submicroscopic malaria infections. As the majority of subclinical infections were caused by P. vivax, the commonest form of malaria in the Amazon rain forest, future studies should investigate the potential of Pvr47/Pfr364 to detect mixed-malaria infections in the field
