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Previous issue date: 2006Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.A tuberculose mata aproximadamente 3 milhões de pessoas no mundo a cada ano. A pobreza, a falta de informação, a demora no diagnóstico de cepas resistentes e multi-resistentes e fatores de risco associados à infecção por Mycobacterium tuberculosis são os principais responsáveis pela manutenção de sua transmissão. Em nosso estudo, utilizamos duas abordagens moleculares, baseadas na reação de PCR, \201CSingle Strand Conformational Polymorphism-SSCP\201D e \201CReverse Line Blot Hybridization\201D-RLBH, para verificarmos genótipos mutantes e a freqüência de mutações no genoma de M. tuberculosis associadas à resistência a drogas, assim como avaliarmos a RLBH para a detecção rápida de resistência. Utilizando o SSCP, verificamos que a versão radioativa apresentou uma melhor resolução que a não radioativa. Na versão não-radioativa uma discordância foi observada (9,1%) ao comparar os resultados com a análise por sequenciamento. Na RLBH, uma membrana contendo sondas para detecção de resistência a: rifampicina, isoniazida, estreptomicina e etambutol foi avaliada em um estudo multi-cêntrico e 50% das cepas resistentes a rifampicina apresentavam mutações em rpoB nos códons 531-TTG (43%) e 526-GTC (7%) enquanto que 49% das cepas resistentes a etambutol apresentavam mutações no códon 306-GTG (34%) e ATA (14%) Uma segunda versão da RLBH, para detecção de resistência a rifampicina com sondas específicas para o gene rpoB foi avaliada. Analisamos 50 cepas de Mycobacterium Bovis, sensíveis e 157 cepas de M. tuberculosis sensíveis e resistentes a rifampicina. Todas as cepas de M. bovis apresentaram o genótipo de sensível e entre as cepas resistentes de M. tuberculosis, 93% apresentaram mutações na região de 157pb do gene rpoB. O Inno-LiPA (teste comercial), baseado em RLBH, para detecção de cepas de M. tuberculosis resistente a rifampicina, também foi analisado, apresentando uma sensibilidade de 97,6%.Concluímos que a hibridação reversa tem a sensibilidade adequada para detectar cepas de M. tuberculosis resistentes a rifampicina e que os mecanismos relacionados à resistência a estreptomicina e isoniazida necessitam de uma melhor compreensão. Na parte deste estudo referente à variabilidade genética de cepas brasileiras de M. tuberculosis, avaliamos a composição de uma região especifica do Complexo M. tuberculosis, a \201CDirect repeat\201D (DR), pela técnica de \201Cspoligotyping\201D Através desta técnica determinamos os genótipos de cepas de M. tuberculosis, de pacientes, provenientes de 11 estados brasileiros e os comparamos com \201Cspoligotypes\201D de 122 países depositados no Banco de Dados Internacional de \201Cspoligotypes\201D. 80% das cepas brasileiras pertencem às famílias dos \201Cspoligotypes\201D \201CLatin-American and Mediterranean\201D (LAM; 46,5%), T (19,7%) and Haarlem (13,3 %). 302 \201Cspoligotypes\201D novos estão distribuídos entre todas as famílias. Dentro da família LAM, uma deleção denominada de RDRio de 26 kB foi detectada e esta deleção está relacionada a 30% dos casos de TB na cidade do Rio de Janeiro. A distribuição de cepas de M. tuberculosis no Brasil parece estar relacionada à colonização brasileira e ao moderno fluxo migratório.Each year, tuberculosis kills, approximately, 3 million people worldwide. Poverty, lack of knowledge (information), late diagnosis of resistant and multi-resistant strains and risk factors associated to Mycobacterium tuberculosis infection are the main reasons (principally responsible) for the maintenance of the (ongoing) transmission. In our study, two molecular
approaches, based on PCR amplification, have been performed, “Single Strand Conformational Polymorphism - SSCP” and “Reverse Line Blot Hybridization - RLBH”, for the identification of mutant genotypes and the frequency of mutations present in M. tuberculosis genome associated to drug resistance, as well as the evaluation of RLBH for the rapid detection of
resistance. The radioactive version of SSCP presented a better resolution than the non radioactive version. In the non-radioactive version, discordance of 9.1% was observed when the results were compared to those obtained by sequencing. Concerning the RLBH, a membrane containing probes designed to detect resistance to: rifampin, isoniazid, streptomycin and
ethambutol was evaluated in a multi-center study and 50% of the rifampin resistant strains showed mutations in rpoB in codons 531-TTG (43%) and 526-GTC (7%), while 49% of the resistant strains to ethambutol presented mutations in codons 306-GTG (34%) and ATA (14%) from embB gene. A second version of RLBH, designed for the detection of rifampin resistance
by specific probes for the rpoB gene, was evaluated. Fifty sensitive strains of Mycobacterium bovis and 157 sensitive and rifampin-resistant strains of M. tuberculosis were analyzed. All M. bovis strains presented a sensitive genotype, while 93% of the M. tuberculosis resistant strains presented mutations in the 157 bp region of the rpoB gene. The Inno-LiPA (commercial test), based in the RLBH for the detection of strains resistant to rifampin, was also analyzed presenting a sensitivity of 97.6%. We have concluded that the RLBH has an adequate sensitivity to detect rifampin-resistant strains and that the mechanisms involved in resistance to streptomycin and isoniazid need a better understanding. Concerning the part of this study
related to the genotypic variability of the Brazilian strains of M. tuberculosis, we have evaluated the composition of the M. tuberculosis complex specific region, the “Direct repeat” (DR) locus, by the spoligotyping technique. Through this technique, we have determined the genotypes of M. tuberculosis strains from patients attended in 11 Brazilian states, which were compared to spoligotypes from 122 countries deposited in the International Database of Spoligotypes. Eighty percent of the Brazilian strains belong to the spoligotyping families “Latin-American and Mediterranean” (LAM; 46.5%), T (19.7%) and Haarlem (13.3%). Three-hundred-and-two new
spoligotypes are distributed in all families. Within the LAM family, a deletion called RDRio was detected and it is related to 30% of TB cases in the city of Rio de Janeiro. The distribution of strains of M. tuberculosis in Brazil seems to be related to the Brazilian colonization and the modern migratory flux
