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Previous issue date: 2016Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.A necessidade de alternativas ao uso de animais no teste de pirogênio é guiada pelo principio dos 3R’s, culminando na aceitação pela Farmacopeia Europeia (FE) do método alternativo in vitro, o Teste de Ativação de Monócitos (MAT). Respeitando esta premissa, o MAT utiliza como matriz, fontes de monócitos humanos sendo considerado um método promissor e eficiente por excluir riscos inerentes à extrapolação inter-espécies, detectar amplo espectro de pirogênios e suprir limitações dos testes atuais, i.e o Teste de Endotoxina Bacteriana (LAL) e o Teste de Pirogênio em coelhos (RPT). Apesar das vantagens abordadas, alguns obstáculos técnico-científico-regulatórios devem ser transpostos para a implantação efetiva do MAT na rotina industrial, em especial, de produtos biológicos. Neste contexto, o Laboratório de Controle de Qualidade de Bio-Manguinhos (Seção de Controle Biológico) em colaboração com o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), visando reforçar a melhoria nos ensaios de controle de qualidade e fortalecer cientificamente o uso dos testes alternativos seguindo os pré-requisitos regulamentados pelas farmacopeias, selecionou de seu portifólio como alvo de estudo, a vacina contra a febre amarela (VFA) como primeiro modelo de aplicabilidade do MAT em vacinas virais por: (1) ser o carro-chefe de Bio-Manguinhos, (2) apresentar processo de produção complexo, com fatores críticos de interferência como uso de vírus vivo e resíduos de componentes de processos (ovos embrionados) e (3) possibilitar potencial investigativo de outras fontes pirogênicas não detectadas pelo método descrito na monografia da vacina. Os métodos farmacopeicos descritos para o MAT utilizando IL-1/sangue criopreservado, IL-6/ sangue fresco e a proposta de método para rotina industrial utilizando IL-6/ sangue criopreservado, foram validados conforme requisitos da FE. A verificação produto-específica foi realizada com a VFA/10 doses e fatores interferentes avaliados através da máxima diluição válida. Após determinação da diluição, o método quantitativo foi aplicado aos lotes vacinais, com interpretação entre os sistemas de leitura e matrizes do MAT e LAL. Os dados mostram reprodutibilidade do teste utilizando diferentes doadores e medidores de pirogenicidade (IL-6/IL-1) frente ao estímulo da endotoxina. Após verificação da aplicabilidade do MAT à VFA com diluição 1:10, demonstramos que os sistemas utilizando sangue criopreservado (IL-1β/IL-6) respeitam os limites de recuperação da endotoxina e se mostraram mais adequados do que o sistema IL-6/sangue fresco. Os resultados quantitativos da resposta pirogênica no produto - determinada pelo MAT - correspondem àqueles observados pelo LAL. Os dados demonstram a aplicabilidade do MAT em vacinas, sendo o modelo VFA compatível com a utilização.The need for alternatives to animal use in pyrogen test is guided by the principle of the 3R’s, culminating in the acceptance by the European Pharmacopoeia (EP) of the Monocyte Activation Test (MAT). Respecting this premise, human monocytes sources are used at MAT, which is considered a promising and efficient alternative method. This method is effective for exclude inherent risk of the interspecies extrapolation, detects a broad spectrum of pyrogens and overcomes limitations of current tests, i.e. the Bacterial Endotoxin Test (LAL) and Pyrogen Test conducted in Rabbits (RPT). Despite the advantages mentioned above, some technical-scientific and regulatory obstacles must be overcome for effective implementation of MAT in the industrial routine, especially for biological products. In this context, the Quality Control Laboratory of Bio-Manguinhos (Biological Control Section) in collaboration with the National Institute for Quality Control in Health (INCQS) started this study aimed to improve the quality control process of biologicals and to consolidate the scientific development of alternative methods in this field, following requirements recommended by regulatory agencies. The vaccine against yellow fever (YFV) was selected to evaluate the applicability of MAT. The reasons for this choice includes: (1) YFV is the flagship product of Bio-Manguinhos’s portfolio, (2) YFV’s production is a complex process, with critical factors of interference such as, the use of live virus and the presence of residual process components (embryonated eggs), and (3) this study enables further investigations concerning other pyrogenic sources not detectable by the method described in the YFV’s monograph. The pharmacopeial methods (MAT using IL-1/blood cryopreserved and IL-6/fresh blood) and the proposed method for industrial routine (IL-6/blood cryopreserved) were validated following the EP requirements. The product-specific verification was carried out with the YFV/10 doses and interfering factors was evaluated by the maximum valid dilution. After determining the dilution, the quantitative method was applied to vaccine lots, with interpretation between the reading systems of MAT and LAL. The data have shown the reproducibility test using different donors and pyrogenicity endpoints (IL-6/IL-1) compared to the stimulation of endotoxin. After assessing the applicability of YFV with the MAT 1:10 dilution, we demonstrated that systems using cryopreserved blood (IL-1β/IL-6) respects the limits recovery of endotoxin and were more suitable than the IL-6 system/fresh blood. The quantitative results of the pyrogenic response in the final product - determined by MAT - correspond to those observed by the LAL. The data demonstrate the applicability of MAT for batch release process of viral vaccines and that the YFV model is compatible with the use of this alternative method
