Estudo do polimorfismo genético, resistência a antimicrobianos e fatores de virulência em isolados de Acinetobacter baumannii coletados de dois hospitais da rede pública do município do Rio de Janeiro entre 2010 e 2011

Abstract

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Entre as espécies desse gênero, A. baumannii tem se destacado, sendo responsável por infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS). No Brasil, esse micro-organismo é um motivo de preocupação por conta da sua alta prevalência no ambiente hospitalar e multirresistência a antimicrobianos. De acordo com o último relatório da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), em 2013, A. baumannii foi classificado como o quarto patógeno mais prevalente entre os pacientes de unidades de terapia intensiva (UTI). Neste estudo, tivemos como objetivos confirmar a identificação de 92 isolados de A. baumannii coletados de dois hospitais públicos do Rio de Janeiro, durante um período de um ano, utilizando testes bioquímicos e métodos moleculares. Além disso, caracterizar fenotipicamente e molecularmente a resistência a antimicrobianos, determinar a diversidade genética e avaliar fatores de virulência desses isolados. A análise da sequência do gene rpoB foi realizada para confirmar a identificação da espécie A. baumaunnii de todos os isolados. Além disso, em 93,5% (n=86) dos isolados, foi verificado o perfil de multirresistência (MDR). Dentre os isolados MDR, 93% (n=80) foram resistentes aos carbapenemas (imipenem e meropenem) e 80,2% (n=69) foram resistentes a polimixina B, para esse antimicrobiano os isolados apresentaram valores de Concentração Inibitória Mínima entre 4-64 g/mL. Por PCR, verificamos que todos os isolados estudados possuíam o gene blaOXA-51 e o gene da sequência de inserção ISAba1, 93,5% (n=86) dos isolados apresentaram o gene blaOXA-23 e não houve detecção dos genes blaOXA-24, blaOXA-58 e blaOXA-143. Dentre os 12 isolados sensíveis ao imipenem, 41,6% (n=5) apresentaram o gene blaOXA-51, o blaOXA-23 e o ISAba1. Através da análise do polimorfismo genético desses isolados por PFGE, observamos a presença de 22 clones (A ao U), sendo dois clones prevalentes, o A (30,4%, n=28) e o B (18,5% n=17), que estavam presentes nos dois hospitais estudados. A capacidade dos 92 isolados formar biofilme também foi avaliada, nesse estudo, observamos a produção de biofilme em 79,3% (n=73) dos isolados. Um isolado representativo de cada clone prevalente (A e B) e de quatro clones esporádicos (C, D, E e F) foram selecionados para a avaliação do grau de associação por microscopia óptica às células A-549 e HEp-2. De maneira geral, foi observada maior associação dos isolados às células HEp-2. Após realizarmos o ensaio de contagem das unidades formadoras de colônia (UFC), podemos sugerir que os isolados de A. baumannii são capazes de aderir, mas não invadir as células HEp-2. Por fim, quando avaliamos a viabilidade celular por reação enzimática de redução do sal metiltetrazólio (MTT), notamos resultados condizentes com os observados pela microscopia óptica. Esse estudo pode auxiliar no monitoramento da resistência, conhecimento da epidemiologia molecular e compreensão da patogenicidade de A. baumannii. A partir dos resultados obtidos, medidas de controle podem ser implementadas para proteger e promover a saúde da população.Acinetobacter spp. has been increasingly reported as important nosocomial pathogen worldwide. Among the species of this genus, A. baumannii has excelled like an important opportunistic pathogen, responsible for infections related to health assistance (IRHA). In Brazil, this microorganism is a cause for concern because of their high prevalence in hospitals and multi-resistance to antimicrobials. According to the latest report of the National Health Surveillance Agency (Anvisa), in 2013, A. baumannii was ranked as the fourth most prevalent pathogen among intensive care unit’s patients (ICU). In this study, our objectives were to confirm the clinical identification of 92 isolates that were collected from two public hospitals in Rio de Janeiro, during a period of one year, for this, we used biochemical and molecular methods. In addition, we characterized phenotypically and molecularly antimicrobials resistance to determine the genetic diversity and to assess virulence factors of these isolates. Sequence analysis of the rpoB gene was performed to confirm the identification of all clinical isolates as A. baumannii. Furthermore, in 93.5% (n=86) of isolates was checked multidrug resistance (MDR) profile. Among the MDR isolates, 93% (n=80) were resistant to cabapenemas (imipenem and meropenem) and 80.2% (n=69) were resistant to polymyxin B, for this antimicrobial, the isolates exhibited Minimum Inhibitory Concentration (MIC) values between 4 - 64 g/mL. By PCR, we verified that all the isolates had blaOXA-51 gene and the insertion sequence gene ISAba1, 93.5% (n=86) had the blaOXA-23 gene and there was no detection of blaOXA-24 genes, blaOXA-58, and blaOXA-143. Among the 12 isolates sensitive to imipenem, 51.6% (n=5) had the blaOXA-51 gene, blaOXA-23 and ISAba1. Through the analysis of genetic polymorphism of these isolates by PFGE, we noted the presence of 22 clones (A to U), two prevalent clones, A (30.4%, n=28) and B (18.5%, n=17), that were present in two hospitals studied. The ability of the 92 isolates to form biofilm was also evaluated, in this study, we observed biofilm production by 79.3% (n=73) of isolates. One isolate representative of each clone prevalent (A and B) and four sporadic clones (C, D, E and F) isolates, were selected to evaluate the degree of association, by optical microscopy, to A-549 and HEp-2 cells. In general, when we compared this association, we observed a higher association with HEp-2 cells. After we realized the counting of colony forming units test (CFU), we suggest that the isolates of A. baumannii are able to adhere but not invade HEp-2 cells. Finally, when we assessed the cell viability by enzymatic reduction reaction of metiltetrazólio salt (MTT), we notes consistent results with the results observed by optical microscope. This study may assist the monitoring of resistance, knowledge of the molecular epidemiology and understanding of the A. baumannii pathogenicity. From these results, we can implement control measures to protect and promote the health of the population