Avaliação do perfil fenotípico e genotípico de isolados clínicos de Histoplasma capsulatum no Ceará, e sua relação com os aspectos clínico-epidemiológicos
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lisandra_damasceno_ini_dout_2016.pdf: 31669587 bytes, checksum: 4c920783b4be7df0bb70abf2f1c4480c (MD5)Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Histoplasma capsulatum, agente da histoplasmose clássica, é encontrado com grande frequência em toda América. Diferenças genéticas previamente observadas entre H. capsulatum isolados de diferentes regiões geográficas do mundo permitiram especular que genótipos distintos estão associados com as formas clínicas da enfermidade. O objetivo deste estudo foi caracterizar a variabilidade fenotípica e genética de isolados de H.capsulatum do Ceará, e avaliar a relação destas características com os aspectos clínico-epidemiológicos dos casos de histoplasmose diagnosticados no Hospital São José de Doenças Infecciosas (HSJ), Ceará, no período de 2011-2014. Dados clínicos e epidemiológicos foram obtidos através da revisão de prontuários médicos no HSJ. A realização dos testes fenotípicos e estudos moleculares foram conduzidos no Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, da Fundação Oswaldo Cruz (INI/Fiocruz) e Universidade Autônoma do México (UNAM). Características fenotípicas dos isolados fúngicos foram identificadas após 21 dias de cultivo no meio Agar Batata Glicosado, sendo descritos aspectos relativos à macro (textura, pigmentação) e micromorfologia. Teste de conversão dimórfica foi realizado no meio ML- Gema. Teste de exoantígenos foi avaliado através de imunodifusão radial dupla e Western Blot (WB). Estudos moleculares foram realizados através de reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando os seguintes marcadores moleculares: lócus MAT1, região ITS, microsatélite (GA)n e sequenciamento multilocus (MLST) de quatro genes nucleares (arf, H- anti, ole1, e tub1) em todos os isolados fúngicos Análises estatísticas foram realizadas no STATA 11.2, e análises filogenéticas através de diversos softwares (MEGA 6, PAUP, Phylm). Durante o período do estudo, um total de 43 hospitalizações ocorreram em 40 pacientes, sendo identificados 51 isolados fúngicos. A maioria das colônias apresentou pigmentação branca e branco-bege (70,6%), e tinham textura cotonosa (82%). A presença de todas as estruturas de esporulação nas colônias filamentosas foi observada em 74,5% dos isolados. Conversão dimórfica ocorreu em 98% das cepas. Ambos os antígenos H e M foram identificados em 54,9% dos isolados através de WB. Dentre os 51 isolados fúngicos estudados, 53% eram MAT1-2, e 47% MAT1-1. Colônias pulverulentas foram associadas com a presença de manifestações hemorrágicas nos pacientes, e colônias de pigmentação branca e branco-bege foram relacionadas à insuficiência renal aguda. Óbito foi associado com a presença de isolados que continham todas as estruturas de esporulação. Análise filogenética identificou uma população genética restrita ao Ceará/Brasil. Além disso, observaram-se ainda quatro haplótipos diferentes ao grupo de isolados do Ceará, sendo dois haplótipos descritos pela primeira vez no mundo. Através de análise de MLST foi possível confirmar a presença de uma nova população genética de H. capsulatum circulante no Ceará, com dois subgrupos genéticos diferentes entre os isolados fúngicos, com significante taxa de recombinação genética. Diferentes fenótipos, e genótipos, incluindo a presença de MAT1-2, que ainda não havia sido identificado no Brasil, foram observados neste estudo. Além disso, isolados de H. capsulatum procedentes do Ceará constituíram um novo grupo genético, com diferentes subpopulações.Histoplasma capsulatum is the etiologic agent of histoplasmosis. It is found in endemic areas around the world, mainly in the Americas. A high genetic variability has been observed among H. capsulatum isolates from different regions, and some genotypes have been associated to pathogenesis of histoplasmosis. The aim of this study was to characterize the phenotipc and genetic variability of H.capsulatum isolates from Ceará/Brazil. In addition, the relationship between the phenotype and genotype with epidemiologic and clinical aspects of histoplasmosis-patients diagnosed at Hospital São José de Doenças Infecciosas (HSJ), Ceará, during 2011 to 2014 period, was evaluated. Epidemiologic and clinical data were obtained by review of medical records. Phenotypic and molecular studies were conduceted at Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, da Fundação Oswaldo Cruz (INI/Fiocruz) and Universidade Autônoma do México (UNAM). Phenotypic characteristics were observed after 21 days of culture in Potato Dextrose Agar. The macromorphological aspects about texture, pigmentation, and micromorfology were identified. Dimorphic conversion was performed in ML-Gema Agar. Exoantigens were detected by immunodifusion and Western Blot (WB). Molecular studies were performed by polymerase chain reaction (PCR). The molecular markers used were MAT1 locus, ITS region, (GA)n microsatellite and multilocus sequence type (MLST) of 4 nuclears genes (arf, H-anti, ole1, e tub1). Statistical analyses were performed in STATA 11.2, and phylogenetic analysis by different softwares (MEGA 6, PAUP, Phylm). A total of 43 hospitalizations occurred in 40 patients Fifty-one fungal isolates were identified. Albino and albino-beige colonies were observed in 70.6% of isolates and 82% of strains had cottony appearance. The presence of all characteristic structures of mycelia-form was observed in 74.5% of fungal isolates. Dimorphism occurred in 98% of strains. All fungal isolates were immunoidentificated by WB, Both H and M antigens were observed in 54.9% of fungal isolates by WB in the exoantigen test. Among the 51 isolates included in this study, 53% were MAT1-2 and 47% were MAT1-1. Powdery colonies were associated with hemorrhagic manifestation, and pallid pigmentation with acute renal failure. Colonies that contained macroconidia were associated with death. The phylogenetic analyses of fungal isolates identified one restrict genetic population in Ceará/Brazil, and four distinct haplotypes were presented in the fungal isolates from Ceará. Two news unprecedented haplotypes (GA)n sequence length in that population were also highlighted. MLST analysis also confirmed the detection of a new genetic population, composed mainly for fungal isolates from Ceará. Two different clusters were identified within the study population, with a significant genetic recombination rate. Distinct phenotypes and genotypes, as MAT1-2 idiomorph that there are not been described in Brazil, were identified in this study. In addition, fungal isolates from Ceará constituted a new genetic population of H. capsulatum, with different genetic subpopulations