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rosa_pinho_ioc_dout_2001.pdf: 4508486 bytes, checksum: 51694e4206fa1f971462d585bddaf66c (MD5)Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Neste trabalho, nós estudamos aspectos da doença de Chagas relacionados ao imunodiagnóstico desenvolvendo um novo teste de diagnóstico utilizando saliva, estudamos aspectos relacionados à imunopatologia e isolamos proteinases ácidas do Trypanosoma cruzi. Em nosso primeiro estudo desenvolvemos um teste para o diagnóstico de doença de Chagas. Para isto, utilizamos saliva de pacientes na fase crônica da doença e detectamos, por ELISA, anticorpos específicos da classe IgG em 103 dos 114 testados com 95 e 90 % de especificidade e sensibilidade, respectivamente. Embora, a utilização de soro comparado à da saliva forneça melhores resultados, concluímos que este pode ser um teste alternativo para imunodiagnóstico da doença de Chagas. No segundo estudo caracterizamos os antígenos liberados de T. cruzi que se ligam em células não infectadas de mamíferos. Assim, detectamos através de marcação com metionina (35S), que antígenos liberados por tripomastigotas do T. cruzi, adsorveram-se às células não-infectadas e estes foram identificados com massa molecular de 85-110 e 160-170 kDa. Foi também demonstrado o efeito destes antígenos nestas células por imuno-citoquímica e detectamos aumento de expressão de componentes da matriz extracelular (ECM) como colágeno, laminina e fibronectina. Assim, concluímos, que estes antígenos podem ser importantes na inflamação secundária à infecção pelo T. cruzi No terceiro estudo isolamos, através de coluna de afinidade agarosepepstatina A, duas proteinases (CZP-I e CZP-II) de formas epimastigotas de T. cruzi. A atividade enzimática destas foi observada na região de 56-48 kDa em pH 3,5. O conteúdo de a- hélice, estruturas b, e estruturas não definidas foi de 9, 62 e 17% respectivamente. Ambas as enzimas foram inibidas pelo inibidor clássico pepstatina A (\2A7E68%) e pelo marcador de sitio aspártico protease ativo, 1,2-epoxy-3-(phenylnitrophenoxy) propane (\2A7E80%). Usando-se soros imunes produzidos em coelhos contra estas duas enzimas detectou-se a presença de ambas em todas as formas do parasito (Anexo II). Os resultados obtidos nos permitem concluir que estas proteinases têm características da classe das aspártico poteinases. Ainda, avaliamos a imunogenicidade da proteinase (CZP-II) em camundongos e obtivemos resposta proliferativa proporcional à quantidade de enzima adicionada. Foram também avaliadas, através de imunofenotipagem, as subpopulações das células T presentes ao final da linfoproliferação e verificou-se um predomínio de células CD8+ em relação às células CD4+. Foi ainda observada produção de IFN-g enquanto a detecção de producão de IL-4 foi baixa. Estes resultados sugerem que esta enzima possa ter papel na imuno regulação na infecção pelo T. cruzi no modelo murino.We have studied some aspects of immunodiagnosis and immunopatology in Chagas\2019disease. A new diagnostic test using saliva was developed and aspartic proteinases from Trypanosoma cruzi were isolated. On the first study, we developed a new test for Chagas\2019 disease. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was applied to saliva from chronic infected patients to detect infection by Trypanosoma cruzi. Specific IgG antibodies were detected in saliva from 103 of 114 samples of infected patients and it showed 90,4% of sensitivity and 95% of specificity. This test could be used as an alternative diagnostic method for Chagas\2019 disease. On the second study, we characterized T. cruzi antigens that bound to noninfected mammalian cells. These released T. cruzi trypomastigotes antigens were labeled with (35S) methionine and were able to adsorb to non-infected cells, they showed molecular mass of 85-110 and 160-170 kDa. The adsorption of these antigens to mammalian cells induced an increase expression of extracellular matrix components (ECM) as colagen, laminin and fibronectin as detected by immunohistochemistry. We concluded that these antigens could be important in inflammation secondary to the infection by T. cruzi On the third study, two proteinases (CZP-I and CZP-II) from T. cruzi epimastigotes were isolated by affinity chromatography column. The enzymatic activity of these proteinases was observed at 56-48 kDa region in a pH 3.5. The CZPI and CZP-II content of a-helix, b-structures and random coil were calculated to be approximately 9, 62 and 29%, respectively. Both proteases activities were strongly inhibited by the classic inhibitor pepstatin-A (\2A7E68%) and the aspartic active site labeling agent, 1,2-epoxy-3-(phenyl-nitrophenoxy) propane (\2A7E80%). Hyperimmune rabbit sera against the enzymes were able to detect both enzymes in all parasite stages (attachment II). These results suggested that these proteinases have characteristics of aspartic proteinases. We also studied the immunogenicity of proteinase CZP-II in mice and it showed proliferative response that had direct relation to the amount of enzyme used. Immunophenotyping of the T cells subsets showed predominance of CD8 over CD4 cells and g-IFN production was observed in contrast to lower levels of IL-4. These results suggest that these enzymes could play some role in the immunoregulation of T. cruzi infection in the mouse model
