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Previous issue date: 2015Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.No Brasil, de todas as espécies do gênero Leishmania, a mais frequentemente encontrada
parasitando o homem é a Leishmania (Viannia) braziliensis. Esta espécie pode causar um
amplo espectro de manifestações, desde lesões únicas ao envolvimento mucoso, sendo esta última a complicação mais séria. Análises que visam acessar a variabilidade genética de Leishmania (Viannia) braziliensis são essenciais para o estudo de possíveis correlações entre manifestações clínicas de leishmaniose tegumentar americana (LTA) com parasitos geneticamente variantes e sua origem geográfica. O objetivo do estudo é analisar a
variabilidade genética de isolados de L. braziliensis provenientes de diversas regiões de Minas Gerais. Foi realizado o diagnóstico clínico e molecular de indivíduos portadores de manifestações típicas e atípicas de várias regiões endêmicas do estado e os isolados separados em dois grupos amostrais: o grupo 1 contendo amostras de variadas macrorregiões do estado; e grupo 2 composto por amostras isoladas na terra indígena Xakriabá, em São João das Missões. A identificação específica de todas as amostras como L. braziliensis foi
confirmada utilizando a técnica de PCR-g6pd. A análise da variabilidade genética foi realizada para os marcadores genéticos hsp70, Cpb, ITS1, g6pd e 6pgd. Na PCR-RFLP do hsp70 foram observados dois perfis de restrição: todas as amostras do grupo 1 e as cepas MG15 e MG16 do grupo 2 tiveram perfil de restrição indistinguível ao da cepa L. braziliensis referência, enquanto a maioria as amostras do grupo 2 exibiram perfil de restrição variante. O fragmento obtido pela PCR do hsp70 foi sequenciado e foram observados polimorfismos inclusive no sítio
de restrição da enzima HaeIII. Na PCR-RFLP do Cpb, as amostras do grupo 1 e as cepas
MG15 e MG16 do grupo 2 tiveram perfil de restrição indistinguível ao da cepa referência, enquanto a maioria das amostras do grupo 2 apresentaram perfil de restrição correspondente às demais espécies do subgênero Viannia. O sequenciamento do fragmento revelou polimorfismos inclusive no sítio de restrição da enzima TaqI. Na PCR-RFLP do ITS1 foi observado que as amostras do grupo 1 e as cepas MG15 e MG16 exibiram perfil de restrição semelhante a L. guyanensis, enquanto as amostras do grupo 2 perfil de L. braziliensis. As cepas MG19 e MG27 (grupo 2) exibiram perfis de restrição diferentes das cepas referência utilizadas. O sequenciamento do fragmento da PCR-6pgd exibiu polimorfismos que diferenciam entre as espécies L. braziliensis e L. guyanensis nas amostras estudadas. Os perfis de
restrição e as sequências foram utilizadas em análises estatísticas de classificação por
similaridade por partição e hierárquico. A análise de partição corroborou a divisão das amostras em dois grupos, sugerindo uma maior variabilidade genética entre as amostras do grupo 2. As análises aglomerativas suportaram a de partição onde foi observada associação do grupo 2 com a origem geográfica e presença de manifestações atípicas de LTA não sendo observada
associação com número de lesões. As sequências foram utilizadas em análises filogenéticas onde foi observado que tanto utilizando somente L. guyanensis quanto outras espécies filogeneticamente mais distantes de L. braziliensis como outgroup, a divisão em grupos proposta foi suportada. A partir do painel de amostras de L. braziliensis estudado conclui-se que em Minas Gerais observamos a presença de um grupo de amostras geneticamente variantes, associadas ao perfil atípico de lesões e provenientes da região norte do estado.Leishmania (Viannia) braziliensis is the most common species of Leishmania genus which
parasites humans in Brazil. This species may present a huge spectrum of clinical symptoms,
from single wounds to serious mucosal involvement, which is the most severe complication.
Analyzes that assess the genetic variability of L. braziliensis are essential to clarify a possible correlation between atypical clinical manifestations of LTA with parasites genetically variants and their geographical distribution, and contribute to population structure studies of this species
in Minas Gerais state. The aim of this study was to analyze the genetic variability of Leishmania (V.) braziliensis isolates from different regions of Minas Gerais State. Clinical and molecular diagnosis of patients with typical and atypical lesions from various endemic areas of Minas Gerais were carried out and the isolates were separeted into two sample groups: group 1 containing samples from various geographical regions of the state; and group 2 composed b isolates from Xakriabá Indigenous Reserve localized in São João das Missões district. The
specific identification of samples was performed with PCR-G6PD method and L. braziliensis was confirmed in all of them. The analysis of genetic variability was carried out using genetic markers hsp70, Cpb, ITS1, G6PD and 6PGD. In PCR-RFLP of hsp70 two restriction patterns were observed: all samples from group 1 and MG15 and MG16 isolates of group 2 showed
indistinguishable restriction profile to L. braziliensis reference strain, while most of the Group 2 samples exhibited a variant restriction profile. The hsp70 amplicon was sequenced and polymorphisms were observed even at the HaeIII restriction enzyme’s site. In PCR-RFLP of Cpb, samples of group 1 and MG15 and MG16 strains of group 2 restriction profile were indistinguishable to the reference strain L. braziliensis, while most of the group 2 samples showed restriction profiles identical to other species of the subgenus L . (Viannia). The
sequenced fragment showed polymorphisms including one at restriction site of TaqI enzyme.
Results of ITS1 PCR-RFLP from group 1 and MG15 and MG16 strains were a restriction profile similar to L. guyanensis specie, while Group 2 samples presented L. braziliensis profile. The MG19 and MG27 strains (group 2) exhibited different patterns of those reference strains. The
sequencing of the PCR-6pgd showed inter-species polymorphisms. Restriction profiles and sequences were used in hierarchical, partition and similarity statistical analyzes. The partition analysis confirmed the division of samples into two groups, suggesting greater genetic variability between samples of group 2. The clustering analysis supported the partition where was observed an association of group to the geographical origin and presence of atypical
manifestations of LTA, but no association was observed with number of wounds. The
sequences were used in phylogenetic analyzes and was observed that both using only L.
guyanensis as other more phylogenetically distant species L. braziliensis as outgroup, the division into two groups proposal was supported. Considering the L. braziliensis samples panel studied in this project it is possible to conclud that there is a group of samples genetically variants associated with atypical profile of wounds from the northern region of Minas Gerais state
