Desenvolvimento e aplicação de marcadores moleculares para estudos taxonômicos, genéticos e epidemiológicos em Leishmania (Viannia)

Abstract

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) mariana_boite_ioc_dout_2014.pdf: 6966313 bytes, checksum: b0fff886f9cae412d6b89bbb9cedb343 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, BrasilAs leishmanioses englobam um largo espectro de doenças causadas pelo parasita do gênero Leishmania. É notável o número de espécies descritas, e, apesar de tratar-se de um gênero com alta variabilidade genética, a validade de algumas dessas espécies vêm sendo questionada. A associação entre Leishmania spp. e as diferentes formas clínicas sugere a participação do parasita na manifestação e no prognóstico da doença. Métodos moleculares estão sendo cada vez mais empregados para diagnóstico, estudos taxonômicos, filogenéticos e epidemiológicos envolvendo este parasita. Os métodos utilizados são, entretanto, diversos, comprometendo a reunião de dados e a comparação inter-laboratorial. Sendo assim, o desenvolvimento de um marcador único e robusto, que permita a troca de informações, enriquecerá o conhecimento sobre a diversidade fenotípica e molecular das leishmânias, atendendo tanto a demanda por uma revisão taxonômica do gênero, como para a elaboração de um sistema integrado de identificação e tipagem deste organismo, ponto essencial em estudos epidemiológicos. O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver marcadores multilocus para Leishmania (Viannia) e avaliar sua aplicabilidade em estudos epidemiológicos Os objetivos específicos incluíram: i) o desenvolvimento de um painel multi locus sequence analisys (MLSA) para cepas de Leishmania (Viannia) que circulam no Brasil que permita, concomitantemente, a identificação de isolados e a realização de estudos filogenéticos; ii) o estudo da estrutura da população de cepas de Leishmania (Viannia) quanto à clonalidade e ocorrência de eventos de recombinação pela determinação de perfis de microssatélites; iii) avaliação da aplicabilidade do painel MLSA como ferramenta epidemiológica para as leishmanioses; iv) a descrição de eventos moleculares em leishmânia que podem interferir nos resultados obtidos a partir de marcadores moleculares empregados. Após construção do painel MLSA e determinação de perfis de microssatélites (MLMT) foi possível comparar os dois marcadores. Os resultados a partir de MLMT definiram duas populações principais, uma com cepas de L. (V.) guyanensis da região Amazônia e outra apresentando as cepas de L. (V.) braziliensis, oriundas da costa Atlântica brasileira. Um terceiro grupo, muito heterogêneo, pôde ser definido com cepas de L. (V.) braziliensis da região norte e com as cepas das espécies L. (V.) shawi, L. (V.) naiffi, e L. (V.) lainsoni. Sinais de recombinação foram detectados no grupo formado por cepas identificadas como L. (V.) guyanensis e também naquele composto por cepas de L. (V.) braziliensis da região costeira. A recombinação pode ser uma das justificativas tanto para a grande diversidade encontrada como para a ausência de estruturação clara da população. O MLSA separou as espécies de acordo com a classificação prévia, exceto para L. (V.) shawi e também apontou para ocorrência de recombinação pelo padrão reticulado das redes construídas Ao aplicar o MLSA em uma situação de surto em Santa Catarina, se detectou associação entre características epidemiológicas dos pacientes e os grupos MLSA, com separação de casos importados e autóctones, sinalizando para o potencial como marcador epidemiológico. A partir dos dados MLSA também foi possível realizar um estudo sobre a ocorrência de variação intra-cepa detectada em sequências de DNA de isolados clonados de Leishmania. Foi possível concluir que o painel MLSA construído e validado apresenta-se como boa alternativa para tipagem, estudos taxonômicos e epidemiológicos em L. (Viannia). Como tal pode representar tanto um substituto molecular para o multilocus enzyme electroforesis (MLEE), método-ouro para tipagem de Leishmania, quanto um marcador padrão a ser utilizado em revisão taxonômica do gênero. Mesmo com o advento do sequenciamento completo de genomas, a contribuição do MLSA ainda é relevante, e este se apresenta como potencial marcador epidemiológico, apesar da inclusão de novos genes ser necessária. O estudo com MLMT evidenciou que o mesmo é ferramenta de escolha para estudos de genética de populações em L. (Viannia), mas não para identificação e avaliação taxonômica do subgênero. Demonstrou-se ainda que a plasticidade genômica das leishmânias gera diversidade em tipos de sequencia de DNA e, portanto deve ser sempre considerada em estudos baseados em marcadores molecularesLeishmaniasis represent a broad spectrum of diseases caused by parasite of the genus Leishmania . The number of species described is remarkably high and the status of some has been questioned, although there is indeed a notable genetic variability within this genus. The associati on of Leishmania spp. and the different clinical forms suggests the involvement of the parasite in the prognosis and clinical outcome of the disease. Molecular methods have been often applied for diagnosis, studies of taxonomy, phylogeny and epidemiology. However, the approaches used are distinct, hampering comparisons between laboratories and data assembly. The development of a standard marker which allows exchange of information would contribute to the knowledge over the phenotypic and molecular diversity of Leishmania . It would also enable a taxonomic review as well as the establishment of a standardized and integrated typing system - essential in epidemiological studies. The main objective of this study was to develop multi locus markers for Leishmania ( Viannia ) and to evaluate its applicability in epidemiological studies. The specific objectives were: i) to develop a multi locus sequence analyses (MLSA) panel with Leishmania ( Viannia ) strains from Brazil that allows the species identification and phylogenetic inferences to be performed; ii) to execute a population structure study through microsatellites profiles (MLMT); iii) to evaluate the MLSA panel as an epidemiological tool; iv) t o describe molecular events that may interfere in the results obtained by the molecular markers employed. After MLSA and MLMT, the results could be compared. MLMT defined two main populations, one comprising L. ( V. ) guyanensis and other L. ( V. ) braziliensi s strains from the Atlantic coast; recombination signs were detected for both. A third group, quite heterogeneous, included L. ( V. ) braziliensis strains from northern Brazil and the other species L. ( V .) shawi, L. ( V. ) naiffi, and L. ( V. ) lainson . Recombin ation may justify all the diversity observed and the lack of clear structuration. MLSA was able to differentiate species in agreement with previous classification, except for L. ( V. ) shawi . The reticulate pattern in the networks also pointed to recombinati on occurrence. After applying MLSA over strains isolated from an outbreak in Santa Catarina state, association between MLSA groups and epidemiological characteristics from the patients was detected, in a way that autochthonous and imported cases could be d ifferentiated. MLSA data also allowed the description of intra - strain variation among DNA sequences from cloned Leishmania cultures. The results lead to the following conclusions: the MLSA panel developed and validated represents a good option for typing, taxonomy and epidemiology studies for L . ( Viannia ). It can be chosen as the molecular substitute for multilocus enzyme electroforesis (MLEE), the gold standard for Leishmania typing, and as the standard marker for a taxonomic review as well. Even consideri ng the whole genome sequence approach, the contribution of MLSA is considered relevant, although more loci should be included. MLMT was revealed as the best approach for population genetics in L . ( Viannia ), but not for taxonomic inferences for this subgenu s. It was also demonstrated that genomic plasticity in Leishmania raises intra - strain DNA sequence diversity, and therefore this aspect should be addressed in studies based on molecular marker