Avaliação da expressão gênica de TBET e GATA3 por células T reativas a Leishmania braziliensis em indivíduos curados clinicamente da leishmaniose cutânea

Abstract

Submitted by Anderson Silva ([email protected]) on 2012-05-28T18:06:05Z No. of bitstreams: 1 giselle_af_silva_ioc_bp_0017_2010.pdf: 1838288 bytes, checksum: 8de949a35ec6e17274c973a923f9e69e (MD5)Made available in DSpace on 2012-05-28T18:06:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 giselle_af_silva_ioc_bp_0017_2010.pdf: 1838288 bytes, checksum: 8de949a35ec6e17274c973a923f9e69e (MD5) Previous issue date: 2010CNPqFundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.O perfil de citocinas tipo 1, tipo 2 e reguladoras parece ser determinante para a cura clínica da leishmaniose tegumentar americana. No entanto, pouco se sabe sobre a resposta imune (RI) duradoura responsável pelo controle da infecção por Leishmania em indivíduos curados de leishmaniose cutânea (LC). É provável que o perfil da RI efetora e/ou reguladora desencadeada nesses indivíduos contribua para o desenvolvimento de estratégias vacinais promissoras. O T-bet, GATA-3 e Foxp3 são fatores transcricionais (FT), envolvidos na diferenciação de células T, apontados como moduladores da expressão de genes que codificam citocinas efetoras e reguladoras. Baseado nisso, nosso objetivo foi avaliar se os níveis de expressão gênica de citocinas do tipo 1 (IFNG, IL12A, IL18), tipo 2 (IL4, IL5), reguladoras (IL10) e, respectivamente, dos FT TBET, GATA3 e FOXP3, em resposta aos antígenos de Leishmania estavam associados ao tempo de cura clínica da LC. Foram estudados: pacientes de LC curados há menos de dois anos (LCC2a; n=10), ou que evoluíram para a cura espontânea (CE; n=05). O grupo controle foi constituído de indivíduos saudáveis, sem histórico de leishmaniose (IS; n=08). O RNAm foi extraído das células mononucleares de sangue periférico (CMSP) estimuladas in vitro com antígenos de L. braziliensis. Para a amplificação gênica, foram utilizadas placas de 96 poços contendo simultaneamente todos os iniciadores dos genes alvo, além dos genes constitutivos. O número de cópias de genes foi quantificado pela da técnica de PCR em tempo real. Os resultados demonstraram que não houve alteração nos níveis de expressão de TBET, GATA3, FOXP3 nos grupos de LCC estudados, mas os CE apresentaram níveis significativamente mais elevados para todos os FT analisados. Os LCC>2a tiveram redução na expressão de IL12A em comparação aos LCC<2a (p<0,01), mas não houve alteração em relação ao IFNG. Embora o número de cópias de IL18, IL4 e IL10 fosse mais baixo nos LCC>2a em relação aos LCC<2a, esta diferença não foi significativa. Além dos FT, os CE apresentaram expressão estatisticamente mais elevada de IFNG, IL12A, IL4, IL5, e IL10. Os resultados acima sugerem que os pacientes que curaram espontaneamente apresentaram uma maior capacidade de expressar citocinas do tipo 1, tipo 2 e reguladoras comparadas aos curados que receberam o tratamento. A redução da expressão de genes de citocinas efetoras e inibitórias com o aumento do tempo de cura sugere que este padrão esteja associado com uma resposta protetora bem modulada.The profile of Type 1 and Type 2 cytokines in addition to the expression of transcriptional regulators are determinant for the clinical cure of American tegumentary leishmaniasis (ATL). Despite of all investigation in the field, little is known about the progression of the immune response (RI) after the clinical cure (CL), when the parasite burden and excess inflammation is kept in check by a well regulated immune response. It is probable that the RI profile involving the expression of effector and regulatory molecules contributes to ensure the successful strategy for the immune response against the parasite. T-bet, GATA-3 and Foxp3 are transcriptional factors (TF), involved in differentiation of T cells, these molecules are modulators of gene expression that control effector and regulatory cytokines. Based on that, our aim was to associate the levels of cytokines gene expression of type 1 (IFNG, IL12A, IL18), type 2 ( IL4, IL5) and regulatory molecules (IL10, TBET, GATA3 and FOXP3) in response to Leishmania antigen, to clinical time of cure in CL. Were investigated patients of CL with less than two years of cure (CCL<2y; n=11), more than two years of cure (CCL>2y; n=10), or that evolved to spontaneous healing without intervention (SH; n=05). The control group was composed by healthy individuals, with no history of leishmaniasis (HI; n=08). Total RNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated in vitro with L. braziliensis antigens. The extracted RNA was used to quantify specific gene expression by Real Time PCR using customized assay kits. The experiments showed that there is no change in transcription for TBET, GATA3 or FOXP3 at studied CCL groups, however SH patients have significantly higher gene copy number for all analyzed TF. LCC>2a patients showed reduced expression of IL12A in comparison with LCC<2a (p<0,01), but yet the expression of IFNG was identical in both groups. There is a trend for lower gene copy numbers of IL18, IL4 e IL10 in LCC>2a in comparison with LCC<2a patients, but this difference was not statistically relevant. Besides increased expression of transcriptional regulators, CE patients showed significant increase in gene copy numbers for IFNG, IL12A, IL4, IL5, e IL10. Taken together, our results suggest that patients with spontaneous cure of leishmaniases present a stronger Type 1, Type 2 and regulatory responses when compared to patients that developed progressive disease and received treatment. With increased time of cure, we observed a reduction on gene expression of effector and inhibitory cytokines. This phenomena may represent a pattern of well modulated protective immune response against the parasite