A criopreservação de sêmen humano tem sido amplamente utilizada como método de preservação da fertilidade. A fim de reduzir os danos causados pelo processo de congelamento, diversos estudos utilizaram substâncias antioxidantes e estimulantes, porém, sua eficácia, bem como seu papel no controle funcional dos espermatozoides, não está bem estabelecida na literatura. Assim, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito da suplementação de melatonina e cafeína nas características estruturais e funcionais de espermatozoides pré-criopreservação e pós-descongelamento. Para isso, este estudo prospectivo utilizou 30 amostras seminais de pacientes entre 19 e 45 anos de idade da rotina do Laboratório Androscience entre maio de 2013 e maio de 2017. Todas as amostras foram classificadas como normozoospérmicas, segundo análise seminal inicial de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS). Em seguida, as amostras foram criopreservadas com Human Tubal Fluid modificado sem suplemento ou com 2mM de melatonina. Após o descongelamento, as amostras foram analisadas ou suplementadas com 2 mM de cafeína, incubadas por 15 minutos. Ao final dos experimentos, obtivemos 4 grupos: Amostras pós-descongelamento sem suplementação (CONT), amostras suplementadas com cafeína (CAF), melatonina (MEL) e cafeína + melatonina (CM). Parâmetros seminais de contagem, motilidade e cinética, analisados pelos critérios da OMS e pelo software SCA®, a atividade mitocondrial, pela coloração por diaminobenzidina, avaliação da taxa de fragmentação de DNA, pelo método SCSA® e a dosagem dos níveis de radicais livres de oxigênio (ROS), pelo método de luminescência, foram realizados pré-criopreservação e pós-descongelamento com ou sem suplementação. Os dados foram analisados pelo teste T de Student pareado e pela análise de variâncias de uma via com medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Holm-Sidak, e adotado um alfa de 5%. Observamos redução significativa concentração espermática (p < 0,001), motilidade total (p < 0,001) e progressiva (p < 0,001), parâmetros cinéticos (p < 0,009) e atividade mitocondrial (p < 0,001) e aumento das taxas de fragmentação de DNA (p=0,046) e ROS (p=0,052) nas amostras CONT quando comparadas com as amostras a fresco. Quando suplementadas com cafeína e melatonina, observamos aumento da motilidade progressiva nos grupos CAF (p=0,005) e CM (p=0,048) e aumento da atividade mitocondrial no grupo CM (p < 0,05). Podemos concluir que a associação da suplementação com cafeína e melatonina nas amostras pré-criopreservação e pós-descongelamento demonstrou ser uma ferramenta importante para ser aplicada em amostras criopreservadas para atuarem como substâncias estimuladoras de motilidade espermáticaHuman semen cryopreservation has been widely used as a method of preserving fertility. In order to reduce the damages caused by the freezing process, several studies used antioxidant and stimulant substances, however, their efficiency as well as their role in the functional control of spermatozoa have not been well established in literature. Thus, the goal of this study was to investigate the effect of melatonin and caffeine supplementation on the structural and functional characteristics of pre-cryopreservation and post-thaw spermatozoa. For this, this prospective study used 30 seminal samples from patients aged from 19 to 45 years in the routine of the Androscience Laboratory between May 2013 and May 2017. All samples were classified as normozoospermic, according to the initial seminal analysis following criteria of the World Health Organization (WHO). Then, the samples were cryopreserved with modified Human Tubal Fluid without supplement or with 2 mM of melatonin. After thawing, the samples were analyzed or supplemented with 2 mM of caffeine, and incubated for 15 minutes. At the end of the experiments, we obtained 4 groups: Post-thaw samples without supplementation (CONT), samples supplemented with caffeine (CAF), melatonin (MEL) and caffeine + melatonin (CM). Seminal parameters for count, motility and kinetics, analyzed by WHO criteria and by the SCA® software, mitochondrial activity, by diaminobenzidine staining, evaluation of DNA fragmentation rate, by the SCSA® method, and dosage of radical oxygen species (ROS) levels, by the luminescence method, pre-cryopreservation and post-thaw were carried out with or without supplementation. The data were analyzed by the paired Student\'s t-test and by one-way analysis of variance with repeated measurements, followed by the Holm-Sidak post-test, adopting an alpha of 5%. We observed a significant reduction in sperm concentration (p < 0.001), total (p < 0.001) and progressive (p < 0.001) motility, kinetic parameters (p < 0.009) and mitochondrial activity (p < 0.001), and increased rates of DNA fragmentation (p=0.046) and ROS (p=0.052) production in the CONT samples when compared with fresh sample. When supplemented with caffeine and melatonin, we observed an increase in progressive motility in the CAF (p=0.005) and CM (p=0.048) groups, and an increase in mitochondrial activity in CM group (p < 0.05). We can conclude that that the combination of caffeine and melatonin supplementation in pre-cryopreservation and post-thaw samples proved to be an important tool to be applied in cryopreserved samples to act as substances that stimulate sperm motilit
