Cytotoxic effects caused by 7-ketocholesterol-containing emulsion (OXLE) in tumor cells in culture

Abstract

Oxisteróis são derivados oxigenados do colesterol que podem ser formados por autoxidação ou por atividade de enzimas específicas. Eles apresentam inúmeras atividades biológicas, incluindo inibição da proliferação celular e citotoxicidade. Dentre os oxisteróis, 7-cetocolesterol (7-KC), que difere do colesterol por apresentar um grupamento cetônico no carbono 7, é conhecido por induzir morte celular por diferentes vias. Neste projeto de pesquisa pretendemos avaliar o uso de uma emulsão lipídica contendo oxisterol (OXLE) como veículo para entrega de 7-KC a células tumorais. Os efeitos tóxicos de OXLE foram avaliados nas linhagem celulares RPMI 8226 (mieloma múltiplo) e B16F10 (melanoma). As células foram tratadas com: a) uma emulsão conhecida por atuar funcionalmente como a LDL (LDE); b) OXLE (75 uM até 225 uM de 7-KC); c) 7-KC (100 uM). As distribuições das células nas diferentes fases do ciclo de duplicação celulares foram analisadas por citometria de fluxo com iodeto de propídio. Todos os tratamentos, nestas concentrações, levaram a acúmulo das células de mieloma na fase proliferativa do ciclo celular. Para analisar a resposta apoptótica, nos utilizamos o fluorocromo JC-1, que mede o potencial transmembranar mitocondrial. Ambas a linhagens celulares, quando tratadas com OXLE, apresentaram hiperpolarização do potencial transmembranar associado com progressivo decrescimento do mesmo. Os resultados mostram que os grupos OXLE e 7-KC induziram a uma morte massiva das células de mieloma. OXLE induziu um efeito citostático nas células de melanoma, caracterizadas por alterações de morfologia, com um aumento na polimerização das fibras de actina, hiperpolarização seguida de perda do potencial transmitocondrial (apoptose associada à despolarização) , presença de vacúolos autofágicos como figuras de mielina (morte celular programada do tipo II - Autofagia); e impossibilitando as células de fazer a citocinese, determinado pelo aparecimento de uma população de células poliplóides. Nossos resultados indicam que esta nova emulsão contendo um oxisterol em sua formulação não é apenas um veículo para moléculas hidrofóbicas, mas pode atuar como agente cistotático/citotóxico. A morte mediada por OXLE possui características de apoptose e autofagia. Estes resultados são promissores e o possível use de OXLE in vivo necessita de futuras investigações.Oxysterols are oxygenated derivatives of cholesterol that may be formed by autoxidation or by action of specific enzymes. They exhibit a number of biologic activities including inhibition of cellular proliferation and cytotoxicity. Among oxysterols, 7-ketocholesterol (7-KC), that differs form cholesterol by a functional ketone group at C7, is known to induce cell death by different ways. Herein we evaluated the use of an oxysterol-containing lipid emulsion(OXLE) as a vehicle to deliver 7-KC to tumor cells. OXLE was evaluated regarding its toxicity on RPMI 8226 (multiple myeloma) and B16F10 (melanoma) cell lines. Cells were treated with: a) an emulsion known to act functionally as LDL (LDE); b) OXLE (75 uM to 225uM of 7KC); c) 7KC (100uM). The distribution of cells in the different phases of cell cycle was analyzed by flow cytometry with propidium iodide. All treatments, according to the concentrations, led the myeloma cells to an arrest in the proliferative phases of the cell cycle. To analyze the apoptotic response, we then used a fluorochrome (JC-1), which measures the mitochondrial transmembrane potential. Both cell lines when treated with OXLE had a hyperpolarization of the transmembrane potential that decrease progressively. The results showed that exposure to either OXLE or 7-KC induced a massive death of myeloma cells. OXLE had an cytostatic effect on melanoma cells characterized by morphologic alterations as increased polymerization of actin fibers; hyperpolarization followed by a dissipation of the mitochondrial transmembrane potential (apoptosis-associated depolarization); presence of IX autophagic vacuoles as myelin figures (programmed cell death type II - Autophagy); and impaired cytokinesis, as determined by the emergence of a polyploid population. Our results indicated that this new oxysterol-containing emulsion is not only a carrier for hydrophobic molecules, but it can act itself as a cytostatic/cytotoxic agent. Cell death mediated by OXLE have both apoptosis and autophagy characteristics. These results are promising and the possible use of OxLE in vivo warrants further investigatio