Bofill Deulofeu

Deulofeu, Bofill

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ÜULTIVO EXPERIMENTAL EN CANCEROLOGÍA 473 El cultivo experimental de tejidos y su importancia en cancerología por el doctor Bofill Deulofeu Profesor auxiliar de la facultad de Barc•lona Es sobrada conocida la historia de la técnica de cultivo de tejidos, para que en una conferencia como la presente su expo-sición nos diera datos fundamentales e in-dispensables para la comprensión de los hechos relacionados con el tema de la misma. Séanos permitido sólo recordar que, para conseguir cultivos duraderos de una o va-rias estirpes celulares, precisa guardar cier-tas condiciones búsicas e ineludibles como las siguientes: 1. Asepsia.- De una manera general y en condiciones corrientes, los tejidos ex-plantados no estan provistos de armas efi-caces contra los microbios. Los medios de cultivo que se emplean para las células, constituyen un excelente material nutriti-va para la mayor parte de los microorga-nismos. La multiplicación de las bacterias a 39o c., es mucho mas rapida que la de los tejidos y es por ello que invaden el medio, frenando el crecimiento de las cé-lulas. 2. El soporte.- El crecimiento de un fragmento de tejido (movimiento y mul-tiplicación cclulares) no es posible mas que en presencia de un substrato o sopor-te sólido. Este hecho, establecido por LoEB y por HARRISON1 constituye hoy un prin-cipio directivo al paso que una limitación del método. Si las células nadan en el seno de un medio nutritivo fluído, aceptan la forma esférica y dejan de multiplicarse (HARRISON1 LEWIS). Situados en capa del-gada sobre una superficie sólida (lamina de vidrio o de mica), se estiran, extien-den y emigran sobre la misma, general-mente en capa monocelular. Pero la del-gadez de dicha capa impide los transplan-tes sucesivos sobre otras superfiicies sólidas. Sobre y en el seno de un plasma coagu-lado, las células crecen y emigran con re-gularidad, se disponen en varias capas y no adhieren gran cosa a la superficie sóli-da sobre la que asienta el medio, lo cual hace comodísimos lo s sucesivos trans-plantes. Los autores (CARREL, FISCHER, EPRHUSsi, STRANGEWA YS, LAMBERT1 etc.), 474 Dn. BoFILL DEULOFEU encontraran como explicación mas plausi-ble del hecho la admisión de la existencia de una red de fibrina, sobre la cual, apo-yàndose, emigrarían las células. Nosotros sometimos el hecho a un control experi-mental y llegamos a la conclusión de que no existía red alguna de fibrina en los coagulos examinados, pero sí una estructu-ra micelar ultramicroscópica, a la cual se debería el crecimicnto cclular y por la cual ::;e cxplicarían asimísmo satisfactoriamente las obserYaciones de P. \VErs sobre las mo-dificaciones que sobre el crecimiento de un cultivo imprimen los estados de tensión me-canica del medio. 3. Las fuentes de ene1·gía.-En el seno de una delgada capa de plasma se sitúa un fragmento de tejido, éste empieza a proli-ferar y a aumentar su masa, pero en un tiempo mas o menos corto, según la natu-raleza del tejido en cuestión, cesa toda ac-tividad constructora de nueva materia viva. Esta actividad, que ha mostrada el frag-mento gracias a la presencia de ciertas re-servas nutritivas, se conoce con el nombre de energía Se ha procurada por todos los medios imaginables encontrar la naturaleza quí-mica de dichas reservas nutritivas. De los innumerables estudios realizados sobre el partícula, sólo se ha adquirida un hecho positivo, a saber, que dichas substancias estan contenidas abundantemente en los extractos de tejidos embrionarios, obteni-dos por centrifugación de embriones re-ducidos a papilla. CARREL propone deno-minar "trefonas" a dichas substancias complejísimas, contenidas en el extracto embrionario. De sus investigaciones analí-ticas parece desprenderse que pertenecen a las proteosas, productos hidrolíticos de las proteínas, caracterizados por un cierto valor de la relacÍÓn N amfnico N total 4. La eliminación de los excreta.-Aca-bamos de indicar la significación que las substancias nutritivas poseen para asegu-rar el crecimiento de verdaderos cultivos tisulares. Ahora debemos señalar que, aun dadas las condiciones óptimas de concen-tración de trefonas, los tejidos terminan por parar su crecimiento, si del medio en que viven no se separan los metabolitos de desecho. El método mas eficaz para eli-minarlos consiste en trasladar un frag-mento de cultivo en un nuevo medio, pre-vio lavado del tejido en una solución sa-lina. Esta manipulación se realiza cada 48 o cada 36 horas y comporta cada vez un traumatismo y una variaci5n del volumen del tejido. Por este método es imposib1c obtener un crecimiento continuo y cons-truir una curva única de crecimiento, ex-tendida sobre un prolongada período de tiempo. Es, sobre todo, por obviar dicho incon-veniente que CARREL propone servirse de otra disposición, en la cual el medio com-porta dos fases, una sólida (plasma coagu-lado), que contiene el tejido cultivada, y otra líquida, que baña continuamente la primera y que es facilmente renovable. En las condiciones de esta nueva técnica (fras-cos de CARREL) se consigne el crecimiento continuo de un cultivo, el cual puede du-rar, para tejidos mesenquimatosos o epite-liales, basta tres y cuatro semanas. Toda una serie de esfuerzos (BuRnows, de I-laan) han sido dirigidos para encon-trar un sistema de irrigación continua. El interés de un tal sistema es evidente. Con todo, hoy por hoy, queda todavía por resolver. Nosotros creemos que es por esta vía que deben proseguir las investigacio-nes. 5. Cultivos puros.- Condición indis-CUL'riVO EXPERIMENTAL EN CANCEROLOGÍA 475 pensable para obtener resultados cuantita-tivamente reproducibles y comparables, único método científica de investigación posible, es trabajar con razas celulares puras. Dos métodos principales existen para conseguirlas: uno anatómico, otro fisioló-gico. El primero se funda en la posibili-dad, en ciertos casos, de aislar fragmentos de tejidos constituídos por una sola especie celular. Es por este método que FrscHER ha obtenido cultivos puros del epitelio del iris y que EBELING ha aislado el epitelio tiro ideo. El segundo método es de selección fisio-lógica. Se aprovecha la propiedad que cier-tas células poseen, de desplazarse mas ra-pidamente que otras, o de la mayor o me-nor sensibilidad (o resistencia) de una es-tirpe celular frente a un factor cualquiera. De esta manera se pueden cultivar las cé-lulas del retí culo esplénico en esta do puro: las células amiboideas se desplazan rapi-àamente hacia la periferie, mientras que las del retícula permanecen juntas al frag-mento central transplantada. Las células hepaticas se nutren bien con extracto em-brionario calentado, mientras que en tales condiciones los elementos mesenquimato-sos del hígado perecen, etc. Hasta aquí hemos pasado revista de los grandes principios del método. Ahora va-mos a ocuparnos de algunas particularida-des de los cultivos de células neoplasicas malignas. Los fib1·oblastos malignos Antes de abordar la descripción de los fibroblastos malignos, procedentes de las diversas neoplasias, es necesario considerar los cultivos de fibroblastos que CARREL, en 1924, aisló del sarcoma de Peyton Rous de las gallinas. Como se sabe, este sarcoma fusocelular esta constituído por células de tipo fibroblastico, entre las cuales se en-cuentra una gran cantidad de células ami-boides. CARREL ha intentado poner en ela-ro el papel desempeñado por estas dos ela-ses de elementos diferentes en la génesis del tumor. A tal fin trató de cultivar por se-parado las dos razas. Administrando a frag-mentos del tumor, extracto embrionario en cantidad sufieiente, se consigne hacer des-aparecer por emigración las células amiboi-des y destruir las restantes eligiendo con-centraciones adecuadas de extracto embrio-nario. De esta manera ha conseguido CA-RREL obtener una estirpe de fibroblastos procedentes del sarcoma de Rous y culti-vada durante tres meses. Las inoculacio-nes de dichos fibroblastos a los animales sanos, sólo fueron positivas durante la pri-mera semana; mas adelante dejaron de aparecer los sarcomas de inoculación. Como por otra parte tanto el mismo CARREL co-mo FrscHER demostraran que los elemen-tos amiboides conservaban en cultivo in-definidamente la malignidad, concluye-ron dichos investigadores que los fibro-blastos del sarcoma de Rous no eran 108 elementos portadores de la malignidad, sino simplemente fibroblastos banales. La formación de sarcomas a partir de los cul-tivos jóvenes (l.a semana), debe explicar-se por la presencia sea de elementos de otra naturaleza sea por algunos fibroblas-tos enfermos que mas tarde mueren o cu-ran rapidamente. Sarcoma 10 de la "Crocker Founda-tion". - Mientras en el sarcoma de Rous el elemento enfermo es el macrófago, en el de Crocker de la rata es el fibroblasto el que asume la malignidad. Comparando los cultivos de fibroblastos, procedentes del sarcoma de Crocker, con los de fibroblastos de la rata normal1 se constata que aiQbas clases de cultivos casi 476 DR. BOFILL DEULOFEU no se distinguen desde el punto de vista morfológico. Como detalles diferenciales, sólo se han descrita una mayor refrangi-bilidad del protoplasma y un mayor ta-maño de los fibroblastos malignos com-parados con los normales. La arquitectura de las colonias de fi-broblastos sarcomatosos es idéntica a la de los normales. El límite de crecimiento de la colonia en presencia de extracto em-brionario es mayor: los fibroblastos sar-comatosos no inhiben su crecimiento has-ta los 10 a 12 días o sea basta el momento que la colonia alcanza un diametro de unos 15 a 20 milímetros, mientras que los fibroblastos normales de la rata no pro-liferau activamente mas que basta los 6 días alcanzando en este momento un diametro de 8 a 10 milímetros. La energía residual de las dos razas ce-lulares medida por la duración de la vida y el crecimiento en ausencia de extracto embrionario .se revela como sensiblemen-te igual en los dos casos. Unicamente los fibroblastos sarcomato-Eos fluidifican el plasma de rata y pro-ducen alrededor de la zona de crecimiento una cantidad de acido (revelada por el vi-rage del rojo de fenol añadido al medio de cultivo) incomparablemente superior a la producida por los fibroblastos normales. La concentración óptima de iones H., para la proliferación de los fibroblastos malig-nos, correspon de a un pH = 7 ,5, mien-tras que los fibroblastos normales presen-tau su crecimiento maximo con un pH = 7,3 -7 ,4. Los fibroblastos sarcomatosos pueden ser mantenidos permanentemnte en cultivo, mediante una mezcla de pepto-nas, péptidos y acidos amínicos. Los ací-dos amínicos solos, no son capaces de sub-venir las necesidades nutritivas de los fi-broblastos sarcomatosos. Pero si ademús de acidos amínicos se añade glutation, ceni-zas de hígado y hemoglobina, entonces crecen por largo tiempo los fibroblastos malignos en tal medio sintético. El fibroblasto maligno del sarcoma de J ensen.-Al igual que en el sarcoma de Crocker son los fibroblastos del sarcoma de J ensen los que acarrean los caracteres de malignidad. Estas células son muy sen-sibles al extracto embrionario que sólo to-leran después de un período previo de adaptación. ]_,os productos de la digestión de hígado de vaca constituyen el único medio en el cual los fibroblastos proliferau mejor que en el suero de rata. El mixosarcoma de las gallinas.-Kn.ru-RA ha aislado y entretenido durante un tiempo considerable los elementos de otro tumor, un mixosarcoma de las gallinas, descrito en 1910 por FunNAMI e INAMOTO. La estructura de esta neoplasia es casi idéntica a la de un mixosarcoma humano. El tejido cultivada no se distingue de los fibroblastos ordinari os; la única dife-rencia, consiste en una producción abun-dante de substancia intecelular mucosa. KrMURA ha podido mantener durante tres meses una línea de cultivos del mixosar-coma que nos ocupa. Durante todo el tiempo, los cultivos conservaran su malig-nidad. Cultivos de Carcinoma. - La técnica que A. Fischer ha elaborada para el culti-vo de células carcinomatosas, esta funda-da sobre el mismo principio que el cultivo del sarcoma de Rous. La primera estirpe constituída por FrscHER provienc de un adenocarcinoma del ratón blanco (estirpe de Frankfurt, carcinoma de Ehrlich). El cultivo se realiza en un medio compuesto a partes iguales de una mezcla de 7 5 % de plasma de rata, 25 ro de plasma de gallina ÜULTI\' 0 EXPERIMENTAL EN CANCEROLOGÍA 477 y extracto embrionario o proteosas: esta mezcla permite un buen crcimiento de las células carcinomatosas y presenta al pro-pia tiempo la ventaja de no fluidificarse por la acción fermentativa de las células malignas. El crecimiento se hace todavía mejor si se añaden fragmentos de tejido borno o heterólogo al cultivo. Estos frag-mentos de tejido son muy rapidamente destruídos por las células del carcinoma, las cuales se infiltrau casi siempre en for-ma de gruesos cordones. Debe hacerse no-tar que la malignidad no depende de la presencia de estroma, puesto que se cuiti-van epitelios puros con malignidad ma-nifiesta. Interesante es el hecho de que los epitelios normales formen cultivos dota-dos de mucho mas rapido crecimiento que los cultivos cancerosos. FrscHER lo expli-ca admitiendo que las células cancerosas, mucho mas labiles que las normales, mue-ren y degenerau. 

El cultivo experimental de tejidos y su importancia en cancerología

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El cultivo experimental de tejidos y su importancia en cancerología

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