bitstream/item/224366/1/7.-ELETROFORESE-DE-ACIDOS-NUCLEICOS.pd

GOUVEIA, J. J. de S.

REGITANO, L. C. de A.

A eletroforese é uma técnica utilizada para separar, identificar e purificarmoléculas carregadas (como DNA e proteínas) (Maniatis, 1987)

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			7. ELETROFORESE DE ÁCIDOS NUCLÉICOSJoão José de Simoni GouveiaLuciana Correia de Almeida RegitanoA eletroforese é uma técnica utilizada para separar, identificar e purificarmoléculas carregadas (como DNA e proteínas) (Maniatis, 1987). Este método foiintroduzido por Tiselius, no ano de 1937 (Brammer e Iorczeski, 2002) e é simples,rápido e capaz de separar fragmentos que não são adequadamente separados poroutras técnicas (Sambrook e Russel, 2002).A técnica apresenta basicamente um sistema de suporte (gel de agarose, porexemplo), um tampão no qual está imerso o gel e os eletrodos nas extremidades dacuba onde estão contidos o tampão e o gel. Sob a influência de um campo elétrico, moléculas carregadas e partículasmigram em direção ao pólo oposto. A carga e a massa das moléculas fazem comque elas migrem em velocidades diferentes e, portanto, propiciam a separaçãodestas (Westermeier, 2005). Como os ácidos nucléicos (DNA e RNA) possuemcarga elétrica negativa (devido ao grupamento fosfato) eles sempre migrarão emdireção ao pólo positivo. Então, o fator determinante da taxa de migração será amassa da molécula (quando se fala em ácidos nucléicos, a massa é diretamenteproporcional ao tamanho da molécula).Existem vários meios de suporte que podem ser utilizados (papel filtro,membrana de celulose, gel de agarose, gel de poliacrilamida). No caso dos géis, aporosidade (que tem uma relação direta com a concentração de agarose) determinao poder de separação (Brammer, 2002).			Na escolha do tampão, o principal fator a ser considerado é sua capacidadetamponante. Os dois tampões mais utilizados na eletroforese de ácidos nucléicossão o TAE (Tris, Acetato e EDTA) e o TBE (Tris, Borato e EDTA). O TAE é maisutilizado que o TBE, porém é mais facilmente exaurido durante corridas longas oucom alta voltagem. O TBE, apesar da melhor capacidade tamponante, deve serevitado quando se deseja purificar os ácidos nucléicos do gel (Ausubel, 1994).Alguns fatores alteram a migração das moléculas através do gel, dentre elespodemos citar: concentração de agarose, conformação do DNA e intensidade dacorrente.A concentração de agarose atua de forma importante na eletroforese, pois eladetermina a faixa de tamanho das moléculas de DNA que podem ser separadas. Asrelações entre concentração de agarose e resolução de moléculas lineares de DNAsão apresentadas na tabela abaixo (Maniatis et al., 1982).Tabela 1. Limites de eficiência da separação de DNA em diferentes concentraçõesde agarose (Maniatis, 1987)Concentração de agarose nogel (%)Separação de moléculas de DNA(Kb).Limites de eficiência0,3 60 – 5,00,6 20 – 1,00,7 10 – 0,80,9 7 – 0,51,2 6 – 0,41,5 4 – 0,22,0 3 – 0,1			Para observar ácidos nucléicos em gel de agarose, deve-se corá-los esubmetê-los a uma luz ultravioleta. O corante mais comum é o brometo de etídeo,que se intercala entre as bases do DNA (Ausubel, 1994).7.1. Protocolo para análise de produtos de amplificação e fragmentos dedigestão em gel de agarose gel 1% → 0,3 g de agarose para 30 mL de gel, que deve ser preparado comtampão Tris-Borato-EDTA 1X. Para isso, aplicar 5 µl de produto de amplificação+ 1 µl de loading buffer. gel 4% → 1,2 g de agarose de baixo ponto de fusão para 30 mL de gel, que deveser preparado com tampão Tris-Borato-EDTA 1X. Utilizado para analisar oresultado das digestões com enzimas de restrição. Aplicar todo o produto dadigestão (13 µl) + 2,6 µl de loading buffer.1. Pesar a agarose2. Colocá-la em um erlenmeyer contendo o volume necessário de tampão TBE 1X3. Aquecer no forno de microondas até iniciar a ebulição (aproximadamente 30segundos em potência média para um gel de 30 mL). Agitar o frasco e retornarao forno de microondas por mais alguns segundos4. Aguardar a redução da temperatura para aproximadamente 60 o C e adicionarBrometo de Etídio, na quantidade indicada para cada gel5. Verter no molde previamente nivelado e colocar os pentes6. Após a solidificação, colocar o gel na cuba de eletroforese e cobrir com tampãoTBE 1X			7. Aplicar as amostras acrescidas de loading buffer e aplicar a corrente de acordocom o tamanho do gel A eletroforese deve ser realizada em TBE 1X, a uma voltagem constante na faixade 2 a 5 V/cm (considerando a distância entre os eletrodos). Após a corrida,submergir o gel por 20 minutos em solução de brometo de etídio a 0,5 µg/mL evisualizá-lo sob luz ultra-violeta.  Caso o fundo do gel esteja muito corado, pode-se lavar o excesso de brometo por submersão em TBE 1X por 5 a 10 minutos O Brometo de etídio é um potente agente mutagênico. Utilizar luvas e máscarapara preparar a solução estoque e manipular os géis A luz ultra-violeta produz queimaduras severas. Utilize máscara/óculos deproteção adequados7.2. GEL DESNATURANTE PARA RNAAdriana Mércia Guaratini IbelliPara analisar moléculas de RNA podem ser utilizados géis de agarose epoliacrilamida, desnaturantes ou não. As propriedades desta eletroforese sãobasicamente semelhantes às de eletroforese de DNA (Patel, 1994).A qualidade das moléculas de RNA pode ser analisada em gel de agarosenormal, feito com tampão (TBE, TAE) com água DEPC ou em gel desnaturante.Devido a interações intramoleculares, as moléculas de RNA podem dobrar-se,alterando a estrutura secundária e afetando a migração das moléculas no gel. O geldesnaturante soluciona este problema, pois sob condições desnaturantes as pontesde hidrogênio são rompidas e o RNA migra como molécula de fita simples. Isto			permite avaliar com acurácia a qualidade e o peso molecular do RNA (Sambrook,2002; Maseka, 2005).Dentre os desnaturantes existentes, o mais poderoso, além de caro ealtamente tóxico é o hidróxido de metil mercúrio. Porém, o mais freqüentementeutilizado é o formaldeído, mas pode haver variantes de géis utilizando tiocianato deguanidina, formamida e DMSO. A utilização de cada um deles apresenta vantagense desvantagens de acordo com a escolha do tipo de gel, poliacrilamida ou agarose,diferentes níveis de toxicidade e potencial de desnaturação (Patel, 1994).Os géis polimerizados com formaldeído não coram satisfatoriamente asamostras, de forma que o brometo de etidío deve ser colocado em cada amostraindividualmente, e não no gel, como comumente utilizado (Regitano, 2001).Outro diferencial no gel desnaturante de agarose é a utilização de MOPS (3-N-morfolino ácido propanosulfônico). O MOPS é um excelente tampão paramanutenção de sistemas biológicos em pH neutro. É muito utilizado em biologiamolecular e bioquímica.Figura 2. Exemplo de separação eletroforética. Nos números 1 a 3 são mostradasas bandas 28S, 18S e 5S do RNA, indicando integridade das amostras. O número 4exemplifica uma amostra de RNA degradada.28S18S5S1 2 3 4			7.2. PROTOCOLO DE GEL DESNATURANTE DE AGAROSE 1% COMFORMALDEÍDO (adaptado de Lúcia Elvira Alvares (2001):Reagente QuantidadeAgarose (1%) 0,3 gBuffer 5X (1 x) 6,0 mLFormaldeído (2,2M)* 5,4 mLÁgua DEPC 18,6 mLTotal 30 mL* verificar se o pH do formaldeído é superior a 4A vidraria utilizada para a preparação do gel, assim como a cuba deeletroforese devem estar previamente tratadas contra ação de RNAses.  Todas assoluções empregadas devem ser feitas com água DEPC.    Tampão de corrida 5XReagente QuantidadeMOPS (100 mM) 20,6 gAcetato de sódio 0,05 M (40 mM) 800 mLEDTA 0,5 M pH 8,0 (5 mM) 10 mL1. Pesar o MOPS2. Dissolvê-lo em acetato de sódio 0,05 M. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 2Ne completar o volume para um litro de água DEPC3. Adicionar o EDTA 0,5 M pH 8,0. Guardar protegido da luz4. Diluir este tampão para concentração final de 1X com água DEPCTampão da AmostraReagente QuantidadeTampão de Corrida 5X 300 µLFormamida (50 %) 750 µLFormaldeído (10 %) 150 µLAzul de bromofenol (0,4 %) 0,004 gÁgua DEPC 300 µL			1. Acrescentar 3 µL do tampão da amostra para cada 1 µL de RNA2. Acrescentar 1 µL de brometo de etídio (0,05 µg/µL)3. Incubar as amostras por 15 minutos à 65 °C4. Transferir para um recipiente contendo gelo5. Centrifugar rapidamente para recolher o conteúdo no fundo do tubo6. Manter em gelo até aplicar as amostras no gel7.3. ELETROFORESE EM SISTEMA CAPILARGustavo GasparinDurante décadas, a eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose foiintensamente utilizada como uma das ferramentas mais importantes dos laboratóriosde biotecnologia e bioquímica para a análise de macromoléculas. Nos últimos anos,porém, a eletroforese capilar tem apresentado vantagens em relação à técnica deeletroforese em placas. Para a análise simultânea de amostras, instrumentos deeletroforese capilar com arranjo de capilares são os mais utilizados. Existemaparelhos que possuem desde um único capilar, até 384 capilares, possibilitando amaximização do tempo necessário para as mais diferentes análises, desde detecçãode resíduos de explosivos e drogas, até testes de paternidade.A separação das macromoléculas é conduzida em tubos de dimensões de 15a 100 µm de diâmetro interno, e 36 a 100 cm de comprimento, preenchidos com umeletrólito. O uso do capilar fornece vantagens sobre as placas de gel devido àsrazões geométricas, em que há uma elevada relação entre a área superficial e ovolume interno, permitindo a dissipação eficiente do calor gerado pela correnteelétrica, e possibilitando a aplicação de campos elétricos elevados (100 a 500 V/cm),			o que resulta em separações de alta eficiência, alto poder de resolução, e reduzidotempo de análise.Em geral, um aparelho de eletroforese capilar básico consiste de uma fontede alta tensão, capilares (geralmente de sílica fundida), eletrodos (de platina,normalmente), e um detector apropriado. A fonte de alta tensão é aplicada noseletrodos de platina situados nos reservatórios contendo uma solução eletrolíticaapropriada. As extremidades do capilar são imersas nos reservatórios da solução,para completar o contato elétrico. As amostras normalmente são introduzidas nocapilar por métodos eletrocinéticos, nos quais uma diferença de potencial éestabelecida entre o capilar e o recipiente que contém a amostra, durante um tempopré-determinado.O detector localiza-se em algum ponto do capilar, próximo ao reservatório desaída.A eletroforese capilar em gel (CGE) é utilizada exclusivamente paraseparação de macromoléculas, tais como oligonucleotídeos, fragmentos de DNA, eproteínas. Teve início com a aplicação nas separações de DNA por tamanhomolecular, utilizando colunas preenchidas com gel, denominados géis químicos: umcapilar é tratado com um reagente que estabiliza o gel junto à parede do capilar,através de ligações covalentes. Esse método foi descartado dado o grande númerode problemas que surgiram, tais como aparecimento de bolhas (perda decondutividade), introdução limitada de amostra, retenção de fragmentos com altopeso molecular, e degradação do gel por hidrólise. Tais problemas levaram àformulação de novos sistemas, que foram denominados géis físicos.Géis físicos são matrizes poliméricas hidrofílicas, dissolvidas em tampãoapropriado, que não são ligados à parede do capilar, podendo assim ser substituídos			 a cada separação, o que permite o aproveitamento do mesmo capilar por centenasde vezes, sem perda de eficiência. A uma dada concentração de polímero, as fitaspoliméricas individuais começam a interagir umas com as outras, formando umaestrutura em rede dentro do capilar, possibilitando a separação dos fragmentos deDNA. A concentração polimérica ótima depende do tamanho do DNA a serseparado.7.4. PROTOCOLO PARA ANÁLISE DE PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO EMSISTEMA CAPILARAntes da injeção no capilar, as amostras são desnaturadas em presença deformamida, para evitar que a formação de estruturas secundárias afete a velocidadede migração. Um padrão de tamanhos conhecidos é aplicado junto com as amostraspara permitir a estimativa do tamanho dos fragmentos analisados.Procedimento:1. Preparar o MIX de formamida + padrão interno de tamanho de fragmentos:para cada amostra, colocar 8,85 µL de formamida Hi-Di e 0,15 µL de padrão(GS 500 ROX).2. Aplicar esses 9 µL de MIX em um pocinho da placa de corrida3. Aplicar 1 µL de produto de PCR da sua amostra por pocinho4. Desnaturar as amostras (já na placa de corrida) durante 5 minutos à 95ºC5. Colocar as amostras imediatamente no gelo após a desnaturação,permanecendo por 5 minutos.6. Preparar a injeção das amostras no computador, através do software DataCollection

Eletroforese de ácidos nucléicos.

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Eletroforese de ácidos nucléicos.

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