Anaplasma marginale; Anticorpo; Diagnóstico; Imunofluorescencia; Teste.bitstream/item/133951/1/digitalizar0033.pdfCNPGC

JESUS, E. F. de

KESSLER, R. H.

MADRUGA, C. R.

MIGUITA, C. T.

SACCO, A. M. S.

Anaplasma marginale; Anticorpo; Diagnóstico; Imunofluorescencia; Teste.CNPGC

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Igo-lUE•...'+=c:oolUs•...(1l':;-'"",'o-o'"'~•...O-~"tllU~::J'"(1la::o1«C>Zwr-«(i) MINIST~RIO DA AGRICULTURA - MA . .~~ Em" ••• Brasileira de P","i •• Agro"",,',i •• EMBRAPACentro Nacional de Pesquise de Gado de Corte, CNPGCRodOllieBR 262, km 4. Vila Popular .Caixa Postal 15479100 Campo Grande, MS.ISSN N9 0100-7858'PESQUISAEMANDAMENTO-eN931,Out/86,p.1-4PRODUçAo DE ANTfGENO E ANALISE PRELIMINAR DO TESTE DE IMUNOFLUOREScENCIAINDIRETA PARA O DIAGNÓSTICO DE ANTICORPOS CONTRA Anaplasma marginaZe- . 1ClaudIO Roberto MadrugaRaul Henrique Kessler2Ana Maria Sastre Sacc03Elane Fabrício de Jesus4Cláudio Tadashi MiguitaSterritórioA anaplasmose bovina ocorre endemicamente em quase todo onacional, causando importantes problemas sanitários não somente -em areasdade estabilidade .enzoótica, mas também em áreas de instabilidade enzoótica,como no Estado do Rio Grande do Sul.Para reduzir o efeito da doença sobre a produtividadefundamental desenvolver um sistema eficiente e econômicodos rebanhosde con t roleanaplasmose. Os testes sorológicos se apresentam como uma das formas de seatingir este objetivo, pois estes possibilitam as investigações epidemio-lógicas e a conseqüente determinação da importância sanitária - .e economlcadesta doença nas diversas regiões ecológicas do país.No Brasil a utilização das provas sorológicas para o diagnóstico de an-ticorpos contra AnapZasma marginale é limitada, pois não há produção deantígenos.Por estas razões foi desenvolvida a prova de imunofluorescência indire-ta (IF1) como método de diagnóstico.Os testes de 1F1 vêm sendo realizados desde 1966, e demonstraram termaIor sensibilidade que os demais testes sorológicos utilizados para odiagnóstico de anticorpos contra AnapZasma marginale. Apesar disso, até o1 - .Med.-Vet., H. Sc . , Pe squi.sador da EMBRAPA-CNPGC2Méd.-Vet., Ph.D., Pesquisador da EMBRAPA-CNPGC3Méd .-Vet., M. Sc., Pesquisador da EMBRAPA-UAPNPSA, à disposição do CNPGC4Bo1sista do PIEP5Auxiliar de Laboratório, EMBRAPA-CNPGCr-P_A..;,./_3...,.:1 ':..;.C.::.,.N.:...PG:...;C;..!,..:.Ou.::..:t:.:.,/..:.8.:;..6 'up:..:.·o~2-_4:""-- PESQUISA EM ANDAMENTO --""""presente, esta prova nio foi totalmente aceita, devido aos problemas deespecificidade, isto é, de falsos positivos que se apresentam em algumasocasiões. Isto é devido à fluorescência nio específica decorrente da açiode anticorpos ant ier í trof í licos, auto-anticorpos dirigidos às membranas dascélulas infectadasoou alteradas, precipitados do soro ou do fluorocromo doconjugado e, ocasionalmente, há presença de isoanticorpos específicos con-tra antígenos dos eritrócitos. Muitas tentativas de aperfeiçoamento doteste vêm sendo realizadas, inclusive com a ut í l í aacào de microfluorímetro,que mensura a intensidade da fluorescência.O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma técnica modificada de pro-dução de antígeno e testar diferentes técnicas de montagem do teste.Para a produção do antígeno foram utilizados bezerros da raça Nelore(Bos indicus) com idades variando entre 6 e 8 meses. Todos os animais fo-ram inoculados previamente com 10 mg/dia de dexametazona. As passagens dashen~céas parasitadas aos bezerros susceptíveis foram realizadas após a se-paração do plasma e três lavagens em soluçio tampão fosfato com pH 7,2.No primeiro animal foram inoculados por via endovenosa (e.v.) 200 ml dehemáceas lavadas (HL) com 100% de parasitemia. Quatorze dias pós-inocula-ção (PI), quando a percentagem de hemáceas parasitadas atingiu 20,1% e ohematócrito 23%, foram inoculados 400 ml de HL no bezerro n9 02. Este ani-mal apresentou parasitemia de 13% e hematócrito de 23% no 69 dia PI, sendoproduzido antígeno e passagem de 350 ml de HL para o bezerro n9 03. Foicolhido sangue desse animal para a produção de antígeno no 29 dia PI, quan-do a parasitemia era de 8,8% e, no 39 dia, com~parasitemia de 12,7%. No 69~ia PI, quando a parasitemia decresceu de 30,9 para 18,8%, foram transfe-idos 300 ml de HL para o bezerro n9 04, que desenvolveu a parasitemia deorma muito lenta, não permitindo a preparação de antígeno antes que sur-~issem anticorpos contra A. marginale. Deste animal foram passados 300 ml~e HL para o bezerro n9 05, que no 29 dia PI apresentou parasiternia de),9%, tendo sido coletado támbém sangue para a preparação do antígeno.O sangue foi colhido em solução de citrato de sódio a 3,8% e imediata-~ente lavado em solução tampão fosfato (STF) fria com pH 7,2 por tres ~e-es. Após as lavagens, as hemáceas foram resuspensas no mesmo tampão~ dehane ira a ser obtido um hematócrito entre 30 e 35%. Ao vO-lumeoofinal foiPA/31,CNPGC,Out/86,p.3-4• PESOUI A.EM.ANDAMENTO --,,--""""1acrescentado 1% de soro de feto bovino. Com esse material toram preparadosesfregaços que foram secos sob ventilação. As lâminas de antígeno foramenvoltas em fita adesiva e armazenadas em congelado sob temperatura de-7aoe.Para a montagem da prova as lâminas de antígeno foram retiradas do con-gelador e imediatamente colocadas em estufa a 370e durante 10minutos. Apósesse período a fita adesiva foi retirada e, utilizando-se esmalte opaco,foram feitos círculos de aproximadamente 5 mm de diâmetro em toda a exten-sâo da lâmina. Na primeira fileira do sentido transversal da lâmina foramcolocados os controles positivo forte, fraco positivo e negativo. Os sorosforam testados a partir da diluição inicial 1:80. As lâminas foram coloca-das em incubação a 370C em câmaras úmidas durante 30 minutos. Após esseperíodo, foram lavadas por 3 vezes durante 10 minutos na STF fria e colo-cadas para secar sob ventilação. O conjugadoantiimunoglobulina bovina nadiluição de trabalho (1:40) foi aplicado em todos os círculos com soro eas lâminas voltaram à incubação em câmara úmida por 30 minutos a 370C.Apósesse tempo foram lavadas 2 vezes com STF por 10 minutos, e uma vez por 5minutos, com água destilada tamponada. Após a secagem das lâminas foi co-locada sobre os círculos de esmalte glicerina tamponada a 50%. A leiturafoi realizada em microscópio Zeiss Universal com condensador 111 RS, epi-luminação tendo como fonte luminosa uma lâmpada de mercúrio RBO 50W, e ob-jetiva de imersão 50 com cobertura 0,95 e ocular lOx. Os testes críticosiniciais da prova foram realizados com soros de bovinos criados abaixo doparalelo 320S considerados negativos para determinar a especificidade e comsoros de animais de áreas enzoóticas que apresentavam parasitemia 15 diasantes da colheita do soro.A análise visual de todos os antígenos evidenciou grau mínimo de fluo-orescência não específica. Dois fatores contribuíram para isto: a colheitado sangue parasitado antes do surgimento de anticorpos no bovino inocula-do, evitando desta maneira formação de complexos antígeno-anticorpo; e alavagem imediata deste material. Nesta mesma análise visual foi constatadoque os antígenos produzidos 2 dias PI, além de apresentarem fluorescêncianao específica ainda menor, tiveram maior homogeneidade por serem compos-tos essencialmente por corpúsculos iniciais, enquanto que os antígenos de3 dias PI e, principalmente, aqueles de 6 dias PI possuíam alguns corpus-PA/31,CNPGC,Out/86,p.4-4.-----------------------PESOUISA EMANDAMENTO-----,culos maiores, denominados corpúsculos de inclusão, que fluoresciam ma1Sque outros corpúsculos de inclusão e.iniciais.Até o presente momento, foram realizados testes críticos com o antígenoproduzido 6 dias PIo A prova de IFI apresentou alto grau de especificidadee sensibilidade, 95,3% e 97,9% respectivamente. Estes índices poderão serainda maiores com os antígenos preparado.s 2 dias PIoPortanto, considerando os fatores acima mencionados como críticos naprodução do antígeno e com padronização criteriosa do teste, a IFI podeser utilizada como importante ferramenta para estudos epidemiológicos eimunológicos.

Produção de antígeno e analise preliminar do teste de imunofluorescencia indireta para o diagnostico de anticorpos contra Anaplasma marginale.

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Produção de antígeno e analise preliminar do teste de imunofluorescencia indireta para o diagnostico de anticorpos contra Anaplasma marginale.

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