MADRUGA, C. R.

MORAES, S. da S.

PIRES, P. P.

QUEIROZ, R. A.

MORAES, S. D. S.

Infoteca-e

EmPf8SI1 8rll$ileirll de PesQuislIAgropecuírillEmbrllpll Glldo de CorteMinistério da Agricultura e do AbastecimentoRodovia BR 262, km 4 - Caixa Postal 154 CEP 79002-970 Campo Grande-MSTelefone (67) 76B 2000 Fax (67) 768 2150hnp://www.cnpgc.embrapa.brN2 64, dezembro/2000, p.1-2Cláudio Roberto Madruqa'Rosângela A. Oueiroz?Pedro Paulo Pires"Sheila da Silva Moraes4TESTE ELlSA PARA DETECTAR ANTICORPOS CONTRA AS TOXINAS "C" E "0-DE Clostridium botulinum EM BOVINOSo botulismo foi considerado como a principal causa da mortalidade de fêmeas adultas de bovinosque ocorreu nos últimos anos na região Centro-Oeste do Brasil. Segundo estimativas dos órgãos deinspeção sanitária animal de Mato Grosso do Sul, as perdas com o rebanho bovino no Estado chegaramem torno de 35.000 matrizes entre 1986 e 1987. A imunização contra as toxinas C e D é o métodopreventivo mais eficiente, para evitar os prejuízos causados à pecuária bovina dessa região do país e deoutras da América Latina. Entretanto, a eficiência das vacinas tem sido questionada, pois tem se verifica-do a ocorrência de botulismo em rebanhos imunizados com toxóides C e D.No Brasil, não há disponibilidade de um teste sorológico para detectar anticorpos contra essastoxinas de C/ostridium botu/inum. Esse tipo de teste é útil para determinar o grau de imunidade humoraldos bovinos contra elas, pois os anticorpos são essenciais para neutralização das mesmas. Outra aplica-ção desse teste seria a avaliação da capacidade imunogênica das vacinas, para ser utilizado por órgãosque fiscalizam a qualidade de imunobiológicos. Entre as provas soro lógicas, a imunoadsorção enzimática(ELlSA) é a mais investigada devido a alta sensibilidade, especificidade e simplicidade na sua realização,quando comparada com a microfixação de complemento e a soroneutralização.A técnica descrita é um ensaio imunoenzimático indireto para detectar anticorpos contra as toxi-nas C e D de C. botulinum. Para a padronização e desenvolvimento dos ELlSAs indiretos foi realizada aprodução dos antígenos C e D a partir do sobrenadante de cultura de cepas de C. botulinum, tipos C e D.Esse sobrenadante foi precipitado em solução hipersaturada de sulfato de amônia. Em seguida, essematerial foi centrifugado e, o sedimento, ressuspenso em Tris HCI 0,1 M, pH 7,5. A concentração dosantígenos C e D foi determinada pela dosagem de proteínas totais de acordo com a técnica descrita porLowry et aI. (1951). Na execução do teste ELlSA indireto, utilizou-se a microplaca de poliestireno de 96orifícios da marca Nunc, com os antígenos C e D, respectivamente, na concentração de 2,4 microgramas/mililitro e 0,36 micrograma/mililitro. Após o período de incubação, a microplaca foi congelada à -20°C ouusada imediatamente no teste. Realizou-se o bloqueio com soro eqüino a 1% livre de IgG, diluído em1 Méd.-Vet., Ph.D" CRMV-MS N2 0587, Embrapa Gado de Corte, Rodovia BR 262 km 4, Caixa Postal 154, CEP 79002-970Campo Grande, MS. Correio eletrônico: madruga@cnpgc.embrapa.br2 Mestranda em Biologia Parasitária, Fundação Instituto Oswaldo Cruz/Universidade Federei de Mato Grosso do Sul (FIOCRUZ/UFMS), Av. Brasil 4365, Manguinhos, CEP 21045-900 Rio de Janeiro, RJ.3 Méd.-Vet., Ph.D., CRMV-MS N20875, Embrapa Gado de Corte.4 Méda.-Veta., Ph.D., CRMV-MS N2 1038, Embrapa Gado de Corte.CT-64, dez./2000, p.2 Itampão fosfato pH 7,2, acrescido de 0,1% de Tween 20. Os soros-teste e os controles negativos epositivos foram diluídos a 1:500 e 1: 1000, respectivamente para os ELlSAs indiretos, utilizando os antígenosC 'e D. O conjugado usado foi o anti-lgG de bovino ligado à peroxidase, na diluição de 1:3.000 comantígeno C e, 1:8.000, com o O. Os substratos empregados foram o ácido 5-aminosalicílico !5-ASI e oortofenil diamina (OPO), respectivamente, nos ELlSAs indiretos, para detectar anticorpos contra as toxinasC e D. A linha de corte, que define até que valor de densidade ótica (DOIas soros são negativos, foideterminada com soros de animais comprovadamente negativos. A especificidade dos testes ELlSAsindiretos foi verificada por meio da análise de 32 soros, obtidos de bovinos criados na área de isolamentodo Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Corte, da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EmbrapaGado de Corte). A sensibilidade dos testes foi avaliada pela análise dos soros de bovinos imunizadoscontra botulismo. Após a determinação da sensibilidade e especificidade, a resposta imune humoral dedois grupos de bovinos vacinados foi avaliada, respectivamente, com vacinas comerciais, denominadas,experimentalmente, como G e R.A análise dos 32 soros dos bovinos mantidos em área de isolamento demonstrou que nenhum foipositivo nos ELlSAs indiretos. A especificidade do teste é elevada, porque apenas um soro foi negativo noELlSA indireto com o antígeno C. Esse parâmetro de desempenho do teste ELlSA para diagnóstico deanticorpos contra a toxina D também foi elevado, porque apenas dois soros foram negativos. A média daDO dos soros dos animais vacinados demonstrou que a vacina R é mais imunogênica, pois DOs maiselevadas foram observadas em bovinos que receberam essa vacina. Além disso, as Das verificadas apósrevacinação foram mais elevadas com os soros dos bovinos vacinados com a R do que com os daquelesvacinados com a G.Os resultados dos ELlSAs indiretos demonstraram que essas provas sorológicas podem ser utiliza-das pelo serviço de vigilância sanitária e permitirão uma avaliação e controle da eficiência de imunobiológicosusados como vacinas contra as toxinas C e D de C/ostridium botu/inum.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICALOWRY, O.H.; ROSEBROUGH, N.J.; FARR, A.L.; RANDALL, R.J. Protein measurement with the folin phenolreagent. Journal Biological Chemical, v.193, p.265-275, 1951.Tiragem: 100 exemplares

Teste ELISA para detectar anticorpos contra as toxinas "C" e "D" de clostridium botulinum em bovinos.

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Teste ELISA para detectar anticorpos contra as toxinas "C" e "D" de clostridium botulinum em bovinos.

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