bitstream/item/137691/1/PESQ-EM-ANDAMENTO-50.pdfCNPGC

ARAUJO, F. R.

CRUZ, T. M. da

MADRUGA, C. R.

SCHENK, M. A. M.

Infoteca-e

•Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáfiaEmbrapa Gado de CorteMinistério da Agricultura e do AbastecimentoRodovia BR 262, km 4 - Caixa Postal 154 CEP 79002-970 Campo Grande-MSTelefone (067) 768 2000 Fax (067) 768 2150http://www.cnpgc.embrapa.brPESQUISAEMANDAMENTON5! 50, Junho/1999. p. 1-3o«oo-euE'+-COoeu(f)O+-''w':;(f)(f)O'c-O(f).;;~o.(f)O"Oeu.:!:::J(f)Q)cr:OK(l>ZwI-o:{Claudio Roberto Madruga 1Flábio R. Araújo"Terezinha M. da Cruz"Maria Aparecida M. Schenk"DESENVOLVIMENTO DE UMA PROVA DE IMUNOADSORÇÃO ENZIMÁTICA PARADETECÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA Trypanosoma vivax EM BOVINOS:RESULTADOS PRELIMINARESAté recentemente, no Brasil, descrições da presença de Trypanosoma vivax serestringiam à região Norte, sendo o primeiro relato em búfalos em 1972 no Estado doPará. Somente em 1995, T. vivax foi identificado na região pantaneira de Poconé, noEstado de Mato Grosso, e em Mato Grosso do Sul. Esse dado sugere que estehemoprotozoário está se expandindo no território nacional e tem potencial para atingiroutras áreas, por causa do modo de transmissão. T. vivax tem sido reportado comoresponsável por grandes perdas econômicas à bovinocultura em áreas tropicais, refletidaspor perdas na produção de carne e leite, infertilidade, retardamento no crescimento emortalidade dos animais. A infecção por esse hemoparasito é caracterizada poremagrecimento progressivo, anemia, edema de barbeia, febre, anorexia, oftalmite, diarréiae abortos. Este trabalho teve como objetivo desenvolver um teste de imunoadsorçãoenzimática indireta (ELlSA), a partir de um isolado de T. vivax da região do Pantanal, paradetecção de anticorpos contra esse hemoparasito em bovinos, e disponibilizar uma técnicade diagnóstico sorológico para os serviços de vigilância sanitária, após a avaliação da suasensibilidade e especificidade. O antígeno para o ELlSA foi preparado a partir do sanguede uma vaca mestiça de Nelore da região de Poconé, Mato Grosso, parasitada com T.vivax, e com sintomas clínicos de tripanossomose. A produção de antígeno para o teste1 Méd.-Vet., Ph.D., CRMV-MS N2 0587, Embrapa Gado de Corte, Caixa Postal 154, CEP 79002-970 Campo Grande, MS, Brasil.2 Departamento de Medicina Veterinária, UNIDERP.3 Bolsista CNPq.4 Méda.-Veta., M.Sc., CRMV-MS n2 0157, Embrapa Gado de Corte.PA-50, jun./1999, p.2de imunoadsorção enzimática foi realizada a partir de sangue com 40 hemoparasitos porcampo. O sangue parasitado foi centrifugado a 3.000 rpm durante cinco minutos, e oplasma e a interface de leucócitos foram recolhidos para uma centrifugação a 10.000 rpmdurante 30 minutos. Ao sedimento obtido foi adicionado tampão de lise (tris 100 mM, EDTA10mM, TLCK 0,2 mM, PMSF 2 mM, NP-40 1,0%) e esse material foi homogeneizado emTen-Broeck. Esse processo foi repetido três vezes, seguido por um congelamento por dozehoras a -70°C. Após, foi descongelado em banho-maria e homogeneizado em Ten-Broeck, esubmetido à disrupção ultra-sônica por 4,5 minutos. Finalmente, foi efetuada umacentrifugação por 14.000 rpm por 30 minutos, a 4°C e o sobrenadante foi armazenado a -70°C. A execução da prova de ElISA foi realizada após várias alternativas de padronizaçãoterem sido estudadas. Placas de poliestireno, de 96 poços, com fundo chato e altacapacidade de adsorção de antígeno (Costar-3590), foram sensibilizadas com 100 ~L deantígeno diluído em salina fosfatada tamponada com Tween 20% a 0,1% (Na2HP04 0,01 M;NaH2P04.H20 0,01 M; NaCI 0,01 M) (PBST), por quatro horas, a 4°C, e congeladas por dozehoras a -70°C. Após o descongelamento, foram feitas cinco lavagens com PBST eadicionados 100 ~L por poço dos soros-teste e dos controles, diluídos a 1:500 em PBST. Asplacas foram incubadas a 37°C por 45 minutos em câmara úmida e, em seguida, lavadascomo descrito anteriormente. Posteriormente, foram colocados 50 ~L da anti-lgG bovina,produzida em coelho, conjugada com fosfatase alcalina (Sigma), diluída em PBST a1:24.000, e as microplacas foram incubadas por 30 minutos, a 37°C. Após dez lavagenscom PBST, foram adicionados 50 ~L do substrato p-nitrofenil fosfato (0,5 mg/mL), diluídoem tampão do substrato (dietanolamina 0,1 M; MgCI2 O,05M; NaCI 0,1 M). A reação foiinterrompida a quinze minutos depois pela adição de NaOH, 0,2 M. Os resultados foramobtidos por espectrofotometria, em leitora de microplacas, com filtro de 450 11m. O valordiscriminante entre positivo e negativo foi determinado como sendo a média das densidadesópticas de 61 soros de bovinos provenientes de região considerada livre de T. vivax (Bagé,RS), mais três desvios-padrão. A sensibilidade foi determinada com dezessete soros debovinos infectados naturalmente com T. viva x, provenientes das regiões de Bodoquena, MS,e Poconé, MT, e três animais inoculados experimentalmente via subcutânea com 2 x 104tripomastigotas. Todos os bovinos infectados apresentaram parasitemia pela técnica domicro-hematócrito. A especificidade foi avaliada com 97 soros de bovinos procedentes deT. evansi 102 5 (4,90)20 1 (5,OO)20 O (O,OO)20 O (O,OO)Tiragem: 50 exemplaresPA-50, jun./1999, p.3Bagé, RS, região em que não houve relatos da presença de T. vivax, e de 20 animaisesplenectomizados e mantidos no isolamento da Embrapa Gado Corte, em ambiente livre deinsetos vetores de T. vivax. A dinâmica da produção de anticorpos contra T. vivax embovinos experimentalmente infectados foi estudada com seis bezerros Nelore, de sete mesesde idade, intactos, inoculados experimentalmente com 107 tripomastigotas de T. vivax, porvia endovenosa. As reações cruzadas foram analisadas com soros de bezerros infectadosexperimentalmente com T. evansi, 8abesia bovis, 8. bigemina e Anaplasma marginale. Asensibilidade determinada com soros comprovadamente positivos para T. vivax eespecificidade com soros negativos à 8abesia e Anaplasma foram de 100%. No estudo dedinâmica de produção de anticorpos, todos os bezerros apresentaram parasitemia entre o 3~e o 4~ OPI e as soroconversões ocorreram entre o 6~ e 8~ OPI. Todos os animaispermaneceram soro positivos até o último dia de análise, exceto o bezerro 6, que tornou-sesoronegativo no 38~OPI. Os bezerros 4 e 5 apresentaram parasitemia até próximo do últimodia de análise (36~ e 30~ OPI, respectivamente), enquanto que nos outros quatro animais, sóforam observados parasitos nas distensões sangüíneas no máximo 23 dias PI. Aspercentagens de reações cruzadas são apresentadas na Tabela 1. Os dados obtidos até omomento revelaram que o ELlSA desenvolvido apresentou uma alta sensibilidade eespecificidade na detecção de anticorpos contra T. vivax em bovinos. As principaisconclusões do trabalho até o momento são as seguintes: o teste possui alta sensibilidade eespecificidade, não apresenta reações cruzadas com A. marginale e 8. bigemina e as reaçõescruzadas com T. evansi e B. bovis foram de percentuais baixos. O desempenho deste testerecomenda a sua utilização em estudos epidemiológicos.TABELA 1. Análise de reações cruzadas de bovinos inoculados experimentalmente comTrypanosoma evansi, 8abesia bovis, 8. bigemina e Anaplasma marginaleperante o antígeno de T. vivax no ELlSA.Agente N~de soros analisados N~de reações cruzadas (%)8. bovis8. bigeminaA. marginale

Desenvolvimento de uma prova de imunoadsorcao enzimática para detecção de anticorpos contra Trypanosoma vivax em bovinos: resultados preliminares.

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Desenvolvimento de uma prova de imunoadsorcao enzimática para detecção de anticorpos contra Trypanosoma vivax em bovinos: resultados preliminares.

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