Na drodze do odkrycia oryginalnych NeoLektyn

Abstract

Ze względu na ogromną różnorodność węglowodanów, które pełnią kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, istnieje równie duża liczba enzymów na nie działających. Wśród nich, szczególnie interesujące są hydrolazy glikozydowe, które zdolne są do hydrolizy wiązań glikozydowych, jak również ich tworzenia w określonych warunkach. Co więcej, poprzez pozbawienie ich aktywności hydrolitycznej, hydrolazy glikozydowe mogą zostać przekształcone do białek wykazujących właściwości lektyn, zdolnych do rozpoznawania i wiązania glikozydów. W ostatnich latach użycie katalitycznie nieaktywnych hydrolaz glikozydowych wytworzonych poprzez losową lub ukierunkowaną mutagenezę było opisywane w literaturze. W tej pracy wygenerowano mutanty β-ksylozydazy z Dictyoglomus thermophilum, w których reszta katalityczna E161 została podstawiona w sposób losowy, tym samym tworząc potencjalne neolektyny. Zastosowano dwa różne podejścia do scharakteryzowania wyprodukowanych wariantów β-ksylozydazy w odniesieniu do ich powinowactwa do ksylozydów. Pierwsze podejście oparte było na aktywności mutantów, która powinna być przesunięta w kierunku reakcji tioglikozylacji zamiast hydrolizy, natomiast drugie wykorzystywało chromatografię powinowactwa oraz fakt, iż wyprodukowane neolektyny powinny się wiązać specyficznie do ksylozydów immobilizowanych na złożu. Celem tego projektu było zidentyfikowanie neolektyn otrzymanych z β-ksylozydazy pochodzącej z Dictyoglomus thermophilum oraz scharakteryzowanie tych z interesującymi właściwościami wiązania ksylozydów.Due to the large diversity of carbohydrates and to the fact that they play a crucial role in many biological processes, there is a great variety of enzymes acting upon these substrates. Among them, glycoside hydrolases are of particular interest since they are capable of both cleaving glycosidic bonds and forming them depending on the experimental conditions. Moreover, by inactivation of their hydrolytic activity, glycoside hydrolases can be converted to lectin-like proteins able to recognize and bind glycosides. In recent years, the use of catalytically inactive glycosidases generated through random or site-directed mutagenesis has been reported in the literature. In this study, β-D-xylosidase from Dictyoglomus thermophilum was used to produce mutant enzymes in which the catalytic acid/base residue E161 has been substituted in a random manner, thereby creating potential neolectins. Two different approaches were applied to characterize generated β-xylosidase variants with regard to their affinity towards xylosides. One approach employed screening of enzyme mutants activity that should be shifted towards thioglycosylation instead of hydrolysis, while the other was based on affinity chromatography and the fact that produced neolectins should bind specifically to xylosides immobilized on the resin. The aim of this project was to identify original neolectins from Dictyoglomus thermophilum β-D-xylosidase and to characterize those with interesting xyloside binding properties