Doutoramento em QuímicaThe use of plants with medicinal purposes is an ancient practice still very
common in developing regions, and is rapidly spreading in industrialized
countries. This fact is evidenced by the large number of ethnobotanical studies
found in the literature referring that these plants are often used as decoctions
and infusions. In most studies the reported biological activities are attributed to
the presence of phenolic compounds, due to their antioxidant properties, and to
polysaccharides, with its anti-tumoral properties.
In “Trás-os-Montes” region, some of the most popular infusions used by the
popular medicine are prepared with the dried leaves of Fraxinus angustifolia,
the dried shoots of Mentha suaveolens, and the dried inflorescences of
Pterospartum tridentatum. However, there are no studies about the
polysaccharides present in these infusions. Thus, through the structural
characterization of the polysaccharides present in the infusions of F.
angustifolia, M. suaveolens, and P. tridentatum, the present PhD thesis intends
to evaluate the possible relation between polysaccharides and the
immunostimulatory activity that these infusions might present.
In a preliminary phase, infusions of F. angustifolia were prepared according to
the popular tradition, and it was observed that the obtained water soluble
material contained approximately 85% of material non-retained in C18
cartridges, with hydrophilic characteristics, with the remaining 15% comprising
retained-material with hydrophobic characteristics. It was also shown that the
infusions only contained between 2 and 4% of high molecular weight material
(HMWM), which comprised approximately 30% of carbohydrate material. Sugar
and methylation analysis of the HMWM suggested the presence of pectic
polysaccharides, together with type II arabinogalactans, mannans, and
xyloglucans. However, the amount of material obtained is to low for the
fractionation, and structural analysis of the polysaccharides present. The 4 h
decoction, divided in two periods of 2 h, with water renewal, allowed to increase
the HMWM yield, relatively to the infusions traditional infusions. It was also
observed that the decoction also allowed to increase the HMWM proportion of
carbohydrate material, due to an increase in the proportion of uronic acid
present, although the neutral sugar residues seemed to be detected in similar
proportions. Therefore, in all the experiments subsequently performed, the
HMWM used was obtained through the decoction of F. angustifolia dried
leaves, M. suaveolens dried shoots, and P. tridentatum dried inflorescences.
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After the fractionation, through ethanol precipitation, and anion exchange
chromatography, of the polysaccharides from the HMWM obtained by the
decoction of the vegetable material of the distinct studied plants, it was
observed the presence of high proportions of pectic polysaccharides,
containing type I arabinogalactans, together with minor proportions of type II
arabinogalactans, mannans, and xyloglucans.
The presence of pectic polysaccharides in the extracts from F. angustifolia
was also evidenced through endo-polygalacturonase treatment, and ESI-MS
and ESI-MS/MS experiments. The detection of linked pentose and uronic acid
residues, also seemed to suggest the presence of xylogalacturonan domains in
the pectic polysaccharides from F. angustifolia.
The extracts from F. angustifolia dried leaves also contained type II
arabinogalactans that exhibited a higher structural diversity than those detected
in the M. suaveolens, and P. tridentatum extracts, particularly in the substitution
degree of the galactan backbone, and in the extension of the (1→5)-Araf side
chains. Moreover, for all the plants studied, it was also observed that the type II
arabinogalactans, extracted during the 2nd 2h of the extraction process,
exhibited a substitution degree of the galactan backbone higher than those
extracted during the 1st 2h.
The extracts from P. tridentatum dried inflorescences contained higher
proportions of mannans, and also of xyloglucans, both presenting a substitution
degree higher than those, which were detected in lower proportion in the
extracts of F. angustifolia and M. suaveolens. Through ESI-MS and ESI-MS/MS
it was possible to evidence that the mannans present in the extracts of P.
tridentatum presented acetyl groups on the O-2 of the mannosyl residues. It
was also evidenced that the P. tridentatum mannans were more extensively
acetylated than the mannans detected in the coffee infusion, LBG, and other
non-conventional mannan sources. Moreover, it was detected the presence of
oligosaccharides comprising hexose residues linked to non acetylated pentose
residues, suggesting the possible presence of arabinose residues in the
mannans from P. tridentatum extracts.
The immunostimulatory activity of three fractions isolated from the extracts
of F. angustifolia, M. suaveolens, and P. tridentatum, was tested and an
increase in the NO production by macrophages, without compromising their
cellular viability, was observed. The type I, and type II arabinogalactans
detected in the extracts from F. angustifolia, and M. suaveolens seem to have
contributed for the observed immunostimulatory activity.
For the fraction from P. tridentatum, the mannans acetylation, and the
presence of type I, and type II arabinogalactans seemed to contribute for the
macrophage immunostimulatory activity observed. The possible presence of
storage xyloglucans from the inflorescences seeds, also seems to have
contributed for the immunostimulatory activity registered when the
macrophages were stimulated with higher extract concentrations.
The results obtained allow to conclude that the extracts of F. angustifolia
dried leaves, M. suaveolens dried shoots, and P. tridentatum dried
inflorescences contained high proportions of pectic polysaccharides, exhibiting
type I arabinogalactans, together with other polysaccharides, such as type II
arabinogalactans, mannans, and xyloglucans. This polysaccharide mixture
seems to have contributed to the immunostimulatory activity of fractions
isolated from the extracts of the studied plants. Therefore, as the same type of
polysaccharides seem to be present in the decoctions and in the infusions, it
seems possible that the polysaccharides might contribute for the therapeutic
properties frequently associated by the popular tradition to the infusions of
these plants.O uso de plantas com fins medicinais é uma prática antiga, ainda bastante
frequente em regiões de países em desenvolvimento, e que se tem vindo a
disseminar em países mais industrializados. Este facto é suportado pelo
elevado número de estudos etnobotânicos, onde se refere que estas plantas
são frequentemente usadas na forma de decocções e infusões. Na maioria dos
estudos as atividades biológicas são associadas à presença de compostos
fenólicos e às suas propriedades antioxidantes, assim como aos
polissacarídeos, nomeadamente devido às propriedades antitumorais.
Na região de Trás-os-Montes, algumas das infusões mais utilizadas pela
medicina popular têm por base as folhas secas do freixo (Fraxinus
angustifolia), a parte aérea seca do mondrasto (Mentha suaveolens) e as
inflorescências secas da carqueja (Pterospartum tridentatum). No entanto, não
existe nenhum estudo sobre os polissacarídeos presentes nas infusões das
folhas secas do freixo (Fraxinus angustifolia), da parte aérea do mondrasto
(Mentha suaveolens) ou das inflorescências da carqueja (Pterospartum
tridentatum). Deste modo, com a presente dissertação pretende-se, através da
caracterização estrutural dos polissacarídeos presentes nas infusões de F.
angustifolia, M. suaveolens e P. tridentatum, avaliar a possível relação entre os
polissacarídeos e a atividade imunoestimuladora que estas infusões possam
apresentar.
Numa primeira fase, foram preparadas infusões tradicionais de F.
angustifolia, tendo-se mostrado que o material solúvel das infusões continha
cerca de 85% de material não retido em cartuchos C18 com características
hidrofílicas, sendo os restantes 15% compostos por material retido de
características hidrofóbicas. Mostrou-se ainda que as infusões obtidas apenas
continham cerca de 2 a 4% de material de alto peso molecular (HMWM), que
era composto por cerca de 30% de carboidratos. A análise de açúcares e a
análise de metilação do HMWM sugeriu a presença de polissacarídeos
pécticos, em conjunto com arabinogalactanas do tipo II, mananas e
xiloglucanas. No entanto, a quantidade de material obtido é muito baixa para o
fracionamento e a análise estrutural dos polissacarídeos presentes. A
decocção de 4 h, divididas em 2 períodos de 2 h, com renovação da água,
permitiu um aumento no rendimento em HMWM, relativamente às infusões
tradicionais. Verificou-se ainda, que a decocção também permitiu aumentar a
proporção de carboidratos no HMWM, particularmente devido ao aumento da
proporção de ácido urónico presente, embora os resíduos de açúcares neutros
se encontrassem em proporção semelhante. Deste modo, em todas as
experiências realizadas posteriormente, o HMWM utilizado foi obtido através
da decocção das folhas secas de F. angustifolia, da parte aérea seca de M.
suaveolens e das inflorescências secas de P. tridentatum. Após fracionamento por precipitação em etanol e cromatografia de troca
aniónica dos polissacarídeos presentes no HMWM obtido através da decocção
dos materiais vegetais das diferentes plantas estudadas, verificou-se a
presença de elevadas proporções de polissacarídeos pécticos, contendo
arabinogalactanas do tipo I, em conjunto com menores proporções de
arabinogalactanas do tipo II, mananas e xiloglucanas.
A presença de polissacarídeos pécticos nos extratos de F. angustifolia foi
também evidenciada através do tratamento enzimático com endopoligalacturonase
e de experiências de ESI-MS e ESI-MS/MS. A deteção de
resíduos de pentose ligados a resíduos de ácido urónico também pareceu
indicar a presença de domínios de xilogalacturonana nos polissacarídeos
pécticos de F. angustifolia.
Os extratos das folhas secas de F. angustifolia mostraram conter
arabinogalactanas do tipo II com uma maior diversidade estrutural do que as
que foram detetadas nos extratos de M. suaveolens e P. tridentatum,
particularmente no que diz respeito à substituição das cadeias de (1→3)-Galp
e à extensão das cadeias laterais compostas por resíduos de (1→5)-Araf. Para
além disso, verificou-se que, para todas as plantas estudadas, as
arabinogalactanas do tipo II presentes nas frações obtidas durante a segunda
parte do processo de extração apresentaram uma substituição das cadeias de
(1→3)-Galp maior do que as extraídas durante a primeira parte da extração.
Os extratos das inflorescências de P. tridentatum continham maiores
proporções de mananas e de xiloglucanas, tendo-se detetado estruturas que
apresentaram um maior grau de substituição do que as que foram detetadas
em menores proporções nos extratos de F. angustifolia e M. suaveolens.
Através das técnicas de ESI-MS e ESI-MS/MS, foi possível demonstrar que as
mananas presentes nos extratos de P. tridentatum se encontravam acetiladas
no O-2 dos resíduos de manose. Verificou-se que as mananas presentes nos
extratos de P. tridentatum se encontravam acetiladas em maior extensão do
que as mananas detetadas na infusão do café, na goma de alfarroba e em
outras fontes não convencionais de mananas. Para além disso, também foram
detetados oligossacarídeos contendo resíduos de pentose, ligados a resíduos
de hexose, sugerindo a presença de resíduos de arabinose na estrutura das
mananas de P. tridentatum.
A atividade imunoestimuladora de três frações isoladas a partir dos extratos
de F. angustifolia, M. suaveolens e P. tridentatum foi avaliada, tendo-se
observado o aumento da produção de NO por parte de macrófagos, sem
comprometer a sua viabilidade celular. As arabinogalactanas do tipo I e II
parecem contribuir para a atividade imunoestimuladora observada nas frações
dos extratos de F. angustifolia e de M. suaveolens
No caso da fração obtida a partir dos extratos de P. tridentatum, a
acetilação das mananas, bem como a presença de arabinogalactanas do tipo I
e II parecem ter contribuído para a atividade imunoestimuladora dos
macrófagos observada. A possível presença de xiloglucanas de
armazenamento, provenientes das sementes das inflorescências de P.
tridentatum, também poderá contribuir para a atividade imunoestimuladora
observada quando os macrófagos foram estimulados com maiores
concentrações de extrato.
Os resultados obtidos permitem concluir que os extratos das folhas secas
de F. angustifolia, da parte aérea de M. suaveolens e das inflorescências de P.
tridentatum contêm elevadas proporções de polissacarídeos pécticos,
contendo arabinogalactanas do tipo I, misturados com outros polissacarídeos,
tais como arabinogalactanas do tipo II, mananas e xiloglucanas. Esta mistura
de polissacarídeos mostrou contribuir para a atividade imunoestimuladora de
frações isoladas a partir dos extratos das plantas estudadas. Deste modo, e
como o mesmo tipo de polissacarídeos parece estar presente nas infusões e
decoções, é possível que os polissacarídeos possam contribuir para as
propriedades terapêuticas frequentemente atribuídas pela tradição popular às
infusões destas plantas