Developed is the PCR assay for the detection of the structural genes of toxin co-regulated adhesion piluses - tcpA of different types. Determined are the universal primers, the usage of which provides for the detection of the stated above genes in V. cholerae of various serogroups. With the help of this PCR assay identified is a new variant of tcpA gene in toxigenic cholera vibrio of non-O1/non-O139 serogroup

A. V. Fadeeva

G. A. Eroshenko

G. N. Odinokov

N. A. Sharapova

T. V. Valova

V. V. Kutyrev

Problems of Particularly Dangerous Infections

Directory of Open Access Journals

Проблемы особо опасных инфекций, вып. 111, 2012102Токсинкорегулируемые пили адгезии (ТКПА) являются одним из основных факторов патоген-ности Vibrio cholerae и необходимы для колониза-ции холерными вибрионами тонкого кишечника [4]. Последовательность гена tcpA, кодирующего синтез основного белка ТКПА – пилина TcpA, отличается значительной вариабельностью у холерных вибрионов разных серогрупп, в том числе и у близкородственных холерных вибрионов О1 серогруппы классического и эльтор биоваров, которые имеют лишь 75 % идентич-ности аминокислотной последовательности кодируе-мого белка [1]. У холерных вибрионов не О1/не О139 серогрупп также выявлено несколько вариантов TcpA и кодирующих их генов [3, 4]. В настоящее время для детекции tcpA используются праймеры, компле-ментарные этому гену у V. cholerae серогруппы O1, которые могут выявлять только гены классического или эльтор типов [2]. Поскольку это может привести к ошибкам в определении наличия гена tcpA и непра-вильной оценке патогенного потенциала исследуемых изолятов, целью нашего исследования была разработ-ка ПЦР с универсальными праймерами, обеспечиваю-щими выявление разных вариантов гена tcpA. На основе компьютерного анализа нуклеотид-ных последовательностей генов tcpA у штаммов V. cholerae разных серогрупп, представленных в базе данных NCBI GenBank, нами выявлены консерва-тивные участки ДНК, один из которых расположен в последовательности гена tcpA ближе к 5’ концу, кодирующему N-терминальную часть молекулы пи-лина TcpA, а второй высококонсервативный участок лежит за пределами этого гена и примыкает к гену tcpA с 3’ конца (рисунок, А). На выявленные консер-вативные участки сконструированы праймеры, кото-УДК 616.932:616-07А.В.Фадеева, Г.А.Ерошенко, Г.Н.Одиноков, Н.А.Шарапова, Т.В.Валова, В.В.КутыревРАЗРАБОТКА ПЦР С УНИВЕРСАЛЬНЫМИ ПРАЙМЕРАМИ  ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНА tcpA ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», СаратовРазработана ПЦР для выявления структурных генов токсинкорегулируемых пилей адгезии – tcpA различ-ных типов. Рассчитаны универсальные праймеры, использование которых обеспечивает детекцию этих генов у V. cholerae разных серогрупп. С помощью разработанной ПЦР определен новый вариант гена tcpA у токсигенных холерных вибрионов не О1/не О139 серогруппы.Ключевые слова: возбудитель холеры, гены патогенности, ПЦР детекция.A.V.Fadeeva, G.A.Eroshenko, G.N.Odinokov, N.A.Sharapova, T.V.Valova, V.V.KutyrevDevelopment of the PCR Assay with Universal Primers for the Detection  of Different tcpA Gene VariantsRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, SaratovDeveloped is the PCR assay for the detection of the structural genes of toxin co-regulated adhesion piluses – tcpA of different types. Determined are the universal primers, the usage of which provides for the detection of the stated above genes in V. cholerae of various serogroups. With the help of this PCR assay identified is a new variant of tcpA gene in toxigenic cholera vibrio of non-O1/non-O139 serogroup.Key words: cholera agent, pathogenicity gene, PCR detection. Положение рассчитанных праймеров для детекции различных вариантов гена tcpA на схеме tcp оперона V. cholerae (А),  выявление генов tcpA в ПЦР с помощью универсальных праймеров у штаммов V. cholerae различных серогрупп О1,  классический биовар (Б): 1 – Дакка35; 2 – МАК154, биовар эльтор; 3 – Т4; 4 – 4А, О139; 5 – МО45; 6 – РO-7, O9; 7 – P16136, O28; 8 – P16132, O37;  9 – 1322-69, O74; 10 – P16152, O50; 11 – P-8845; 12 – отрицательный контроль КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ103рые имеют следующий состав: tcpAuniv-S  GAA GAA CAC GAT AAG AAA AC tcpAuniv-AS  CCT TGT TGG TAT TTT CTC ATПодобраны оптимальные условия проведения ПЦР: 1 цикл 94 °С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 94 °С – 45 с, 56 °С – 1 мин, 72 °С – 45 с и завер-шающий цикл – 72 °С – 3 мин.Проведенный анализ эффективности разра-ботанной ПЦР на 130 штаммах V. cholerae, вы-деленных на территории Российской Федерации (Астраханская, Саратовской, Самарская, Ростовская области, Калмыкия) и за рубежом в период с 1960 по 2006 год, показал, что ее использование обеспе-чивает детекцию генов tcpA у штаммов разных се-рогрупп (рисунок, Б). С ее помощью выявляются гены tcpA у штаммов холерных вибрионов О1 серо-группы классического и эльтор биоваров (рисунок, дорожки 1–4), О139 серогруппы (дорожки 5–6) и у токсигенных вибрионов других серогрупп (дорожки 5–10). У нетоксигенных холерных вибрионов (до-рожка 11) ген tcpA, как правило, отсутствует, хотя иногда встречаются нетоксигенные штаммы не О1/не О139 серогруппы, содержащие различные вари-анты этого гена. Среди последних нами выявлены два штамма с геном tcpA классического типа, один из которых был выделен в Астраханской области в 1974 г., а второй – в Ростовской области в 1976 г. Три штамма V. cholerae не О1/не О139 серогруппы с ге-ном tcpA типа эльтор выделены в Ростовской области в 1974–1975 гг. Значительно большее число штаммов с генами tcpA классического и эльтор типов обнару-жено у V. cholerae не О1/не О139 зарубежного проис-хождения. Среди штаммов V. cholerae не О1/не О139 из О-типирующей коллекции Саказаки выявлено 5 изолятов с генами tcpA классического и 7 – с генами эльтор типов. Один токсигенный штамм V. cholerae серогруппы О62 с геном tcpA классического типа был выделен в 1971 г. в Узбекистане, а второй штамм не О1/не О139 серогруппы, полученный на этой же территории в 1986 г., содержал этот ген типа эльтор. С применением рассчитанных универсальных праймеров нам впервые удалось выявить наличие гена tcpA у группы токсигенных штаммов, выделен-ных в Узбекистане в 1987–1990 гг. (рисунок, дорожки 7–8, 10), которые, как считалось ранее, не содержат генов ТКПА. Проведенное секвенирование генов tcpA у этих токсигенных штаммов показало, что их последовательность имеет существенные отличия (165 замен единичных нуклеотидов на ПЦР фраг-менте размером около 730 п.н.) от штамма О1 серо-группы V. cholerae 16961, а также от других штам-мов, представленных в NCBI GenBank. Таким образом, нами разработана ПЦР с уни-версальными праймерами, применение которой обе-спечивает детекцию генов tcpA различных типов. С ее помощью нами выявлен новый вариант (аллель) этого гена у токсигенных холерных вибрионов не О1/не О139 серогруппы.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1. Bertran P., Delgado G., Navarro A., Truhillo F., Selander R.K., Gravioto A. Genetic diversity and population structure of Vibrio cholerae. J. Clin. Microbiol. 1999; 37:581–90. 2. Keasler S.P., Hall R.H. Detecting and biotyping Vibrio chol-erae O1 with multiplex polymerase chain reaction. Lancet. 1993; 341:1661. 3. Nandi B., Nandy R.K., Vicente A.C., Ghose A.C. Molecular characterization of a new variant of toxin-coregulated pilus protein (tcpA) in a toxigenic non-O1/non-O139 strain of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 2000; 68:948–52.4. Taylor R.K., Miller V.L, Furlong D.B. Mekalonos J.J. Use of phoA gene fusion to identify a pilus colonization factor coordinate-ly regulated with cholera toxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987; 84:2833–7.Authors:Fadeeva A.V., Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Sharapova N.A., Valova T.V., Kutyrev V.V. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. Universitetskaya St., 46, Saratov, 410005, Russia. E-mail: rusrapi@microbe.ruОб авторах:Фадеева А.В., Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Шарапова Н.А., Валова Т.В., Кутырев В.В. Рос сийский научно-исследовательский про-тивочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Универ си тет ская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ruПоступила 20.02.12.

Development of the PCR Assay with Universal Primers for the Detection of Different <i>tcpA</i> Gene Variants

https://journal.microbe.ru/jour/article/download/783/734

Development of the PCR Assay with Universal Primers for the Detection of Different <i>tcpA</i> Gene Variants

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Directory of Open Access Journals