Mestrado em Biomedicina MolecularA fosforilação anormal de proteínas é uma das características chave da
Doença de Alzheimer (DA) que pode estar envolvida tanto na patogénese
como na progressão da doença. A fosforilação reversível de proteínas
representa um importante mecanismo regulador que envolve a atividade de
fosfoproteínas fosfatases (FPF) e proteínas cinases (PC). Um desequilíbrio
intracelular entre a actividade de FPF e PC pode alterar a atividade,
localização subcelular e interacções de proteínas, contribuindo para a
desregulação da função e sinalização neuronal e, consequentemente para a
neurodegeneração. Assim, o estudo do fosfoproteoma neuronal da DA tornase
relevante tanto do ponto de vista fisiológico como patológico. Culturas
primárias corticais foram expostas ao ácido ocadáico (AO, um inibidor de PPP)
ou ao péptido β amilóide (Aβ) para mimetizar as condições da DA. Os lisados
celulares foram aplicados numa coluna de afinidade para fosfoproteínas. As
frações enriquecidas em fosfoproteínas foram analisadas por espetrometria de
massa tendo sido desenvolvido um script em linguagem python
(http://sourceforge.net/projects/protdb/) para análise das proteínas
identificadas. Os resultados provenientes das condições Controlo vs AO
indicam que o tratamento com este inibidor de FPF leva a um aumento do
número de fosfoproteínas (174 vs 242 proteínas totais e 32 vs 100 proteínas
exclusivas). Os resultados do tratamento com Aβ indicam uma alteração
qualitativa do fosfoproteoma neuronal (174 vs 166 proteínas totais) com um
número considerável de proteínas exclusivas (42 vs 34 proteínas exclusivas).
Subsequentemente, para a obtenção de informação detalhada e
caracterização das proteínas identificadas em cada condição, foi realizada
uma análise exploratória das fosfoproteínas organizando-as por classe
proteica, processos biológicos, localização subcelular e funções moleculares.
Os tratamentos com AO e Aβ levam a alterações em proteínas envolvidas em
processos celulares que se encontram comprometidos na DA, tais como a
actividade das PC e FPF, degradação proteica, stress oxidativo, folding
proteico, dinâmica do citoesqueleto, síntese proteica e apoptose. A
caracterização do fosfoproteoma neuronal da DA pode revelar ou elucidar os
mecanismos moleculares subjacentes à transdução de sinais anormal
associada com a patogénese da doença. A análise das fosfoproteínas
exclusivas poderá, também, contribuir para a identificação de potenciais novos
biomarcadores ou alvos terapêuticos para a DA.Abnormal protein phosphorylation is a characteristic hallmark of Alzheimer’s
disease (AD) and may be implicated both in pathogenesis or disease
progression. Reversible protein phosphorylation represents a key regulatory
mechanism involving the activity of protein phosphatases (PPP) and protein
kinases (PK). Imbalanced PPP and PK activity can alter protein action,
subcellular localization and protein interactions, thus contributing to abnormal
neuronal function and signaling and consequently to neurodegeneration.
Hence, the study of the AD neuronal phosphoproteome is of physiological and
pathological relevance. Primary cortical cultures were exposed to okadaic acid
(OA, a PPP inhibitor) or amyloid-β peptide (Aβ), in order to mimic AD
conditions. Cell lysates were applied to a phosphoprotein affinity column and
phosphoprotein enriched fractions analyzed by mass spectrometry. A protein
database management framework (http://sourceforge.net/projects/protdb/) was
set up allowing for the development of a script to analyze the identified
proteins. Data from Control vs OA conditions indicates that OA treatment leads
to an increase in phosphoproteins (174 vs 242 proteins and 32 vs 100
exclusive proteins). Data indicates that Aβ treatment leads to a shift in neuronal
phosphoproteome pool (174 vs 166 proteins) with noteworthy alterations in the
exclusive neurophosphoproteome (42 vs 34 exclusive proteins). Subsequently,
analysis of the protein classes, biological processes, subcellular localization
and molecular functions allowed for detailed information regarding the proteins
obtained in the different groups. Upon treatments an alteration in the proteins
involved in critical processes impaired in AD such as PK and PPP activities,
protein degradation, oxidative stress, protein folding, cytoskeleton network
dynamics, protein synthesis and apoptosis was observed. The characterization
of AD neuronal phosphoproteome may reveal or elucidate the molecular
mechanisms underlying abnormal signal transduction associated with AD
pathogenesis. Further, by analyzing the pool of exclusive proteins, this work
may also contribute to identify potential novel biomarker candidates or AD
targets for therapeutic intervention