Eletroforese de proteínas; Preparação da amostra de extrato protéico de peito de galinha.bitstream/CTAA-2009-09/8951/1/ct84-2005.pd

NASCIMENTO, M. da G. F. do

STEPHAN, M. P.

Eletroforese de proteínas; Preparação da amostra de extrato protéico de peito de galinha

Infoteca-e

Obtenção de Padrão deIdentidade de Peito deGalinha Através deEletroforese SDS-PAGEMarilia Penteado Stephan1Maria da Graça Fichel do Nascimento284ISSN 0103-5231Novembro, 2005Rio de Janeiro, RJMinistério da Agricultura,Pecuária e Abastecimento1Farmac., D.Sc., Pesquisadora da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Av. das Américas 29501, Guaratiba,CEP 23020-470. Rio de Janeiro, RJ. E-mail: stephan@ctaa.embrapa.br2 Méd. Vet., Ph.D., Pesquisadora da Embrapa Agroindústria de Alimentos. E-mail: graca@ctaa.embrapa.brA agricultura orgânica tornou-se um dos setores maispromissores no Agronegócio Brasileiro e, nessecontexto, a produção de frangos de corte e aves depostura em sistema orgânico, torna-se uma excelentealternativa para a sustentabilidade da agriculturafamiliar e/ou de pequeno porte. Além do baixo custoda carne de frangos oferecidos ao consumidor, emrelação às demais proteínas animais, trata-se de umalimento nutritivo e saboroso.As carnes são compostas de quatro tipos básicos detecidos: muscular, epitelial, nervoso e conjuntivo(Sgarbieri, 1996). O músculo é o principal componenteda carne, e é composto de três classes de proteínas:sarcoplasmáticas, miofibrilares e estromáticas. Asproteínas sarcoplasmáticas são solúveis em soluçõesde baixa força iônica e representam 30-35% daproteína total da musculatura esquelética. Asmiofibrilares se caracterizam por serem solúveis emsoluções de alta força iônica e representam 52-56%de toda proteína muscular e as estromáticas sãoinsolúveis em solventes aquosos e perfazem o total de10-15% de toda proteína muscular (Sgarbieri, 1996).Quando se caracteriza as proteínas quanto à suafunção biológica, dentro dos nove grupos encontrados(estruturais, transporte, defesa, hormonais, fatores decrescimento, proteínas catalíticas, contráteis,receptoras e de transferência de elétrons), destaca-seque a miosina e a actina pertencem ao grupo dasproteínas contráteis que compõem o tecido muscular.Do ponto de vista nutricional, com raras exceções, asproteínas de origem animal apresentam um melhorequilíbrio de seus aminoácidos indispensáveis e ummaior índice de digestibilidade do que as de origemvegetal (Sgarbieri, 1987).A utilização de eletroforese para estudo de perfilprotéico tem sido utilizada para caracterização devários alimentos protéicos (Kaiser & Krause, 1985),desde a forma in natura (Kaiser & Krause, 1985) até aprocessada (Cheng & Parrish, 1979). Esta técnicatambém tem sido utilizada para identificação deespécies de peixes ou frutos do mar (Craig et al.,1995) o que a torna muito útil para aspectosrelacionados com legislação.Neste trabalho tem-se como objetivo final avaliar oefeito da adição de carvão vegetal na ração degalinha. Também faz parte de uma das atividadesdeste projeto de pesquisa verificar a presença demodificações na composição protéica-molecular nacarne de galinhas orgânicas (peito), além decaracterizar um padrão de identificação da mesma.Como método de identificação foi utilizada aeletroforese, e através da separação do “pool”protéico presente no peito destas galinhas, pode-sefuturamente avaliar o efeito da adição de carvão nadieta das galinhas, criadas dentro de um sistemaorgânico de produção.Eletroforese de ProteínasPara o presente estudo foi utilizado o sistema deeletroforese da Biorad e a metodologia de preparaçãodos géis descrita por Laemmli (Laemmli, 1970). Para ogel de corrida foi utilizada acrilamida na concentraçãode 12% e no gel de aplicação da amostra, esta foiutilizada na concentração de 4%. A corrida foirealizada durante sete horas sob uma tensão de 100V.Os marcadores de alto peso molecular foram obtidos apartir dos seguintes padrões de proteínas (em kDa):220–miosina ; 170-α-macroglobulina; 116-β-galactosidase; 76-transferina; 53-glutamatodesidrogenase. Os marcadores de baixo pesomolecular foram obtidos a partir dos seguintes padrõesde proteínas (em kDa): 97-fosforilase b; 66–albumina;45–ovalbumina; 30-anidrase carbônica; 20,1-inibidorde tripsina; 14,4- α lactalbumina. As proteínas dos2Obtenção de Padrão de Identidade de Peito de Galinha Atravésde Eletroforese SDS-PAGEgéis foram coradas com o reagente de cor “coomassieblue R250”, durante uma noite, e descoradas comuma solução de metanol/ácido acético/H2O (40: 10:50), durante três horas.Preparação da Amostra de Extrato Protéicode Peito de GalinhaAs aves receberam as mesmas condições de manejopreconizadas para criação orgânica, e o experimentofoi realizado na Fazendinha Agroecológica, localizadana Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ. As aves,com idade de 120 dias ao iniciar o experimento, forampesadas, identificadas individualmente, e alocadas nosistema de criação orgânica. Para o estudo dasproteínas extraídas do peito destas galinhas, asamostras foram microprocessadas emmultiprocessador de uso doméstico. As 5g de peito degalinha microprocessado foram homogeneizadas emblender durante dois minutos, usando uma soluçãoaquosa composta de tampão fosfato 20mM, acrescidode KCl na concentração de 0,45M. Teve-se com istouma possibilidade de obtenção de um extratocomposto tanto de proteína sarcoplasmática comomiofibrilar. As 5g de peito de galinha microprocessadaforam homogeneizadas em “blender” durante doisminutos. Após centrifugação durante 20 min., a umavelocidade de 4000 rpm, o extrato foi aplicado em gelde poliacrilamida em duas formas de diluição (1/2  e1/4).Visando obter dados relativos ao teor de proteínas emuma faixa de concentração acima de 12 kDa,introduziu-se a etapa de diálise, usando umamembrana com peso molecular de exclusão de 12kDa. Portanto, o extrato obtido na extração comtampão fosfato (20mM)-KCl (0,45M) foi aplicado nogel para a eletroforese nas seguintes formas: a) nãodialisado b) dialisado em tampão fosfato (20mM)-KCl(0,45M), durante 48 horas. Na Tabela 1, pode-sevisualizar os valores dos pesos moleculares obtidosnos extratos protéicos sem dialisar e naqueledialisado. Pôde-se verificar uma perfeita nitidez dasbandas nos dois tratamentos (Figs.1 e 2), o que indicaque a etapa de diálise é dispensável. Na Tabela 1pode-se verificar que nos dois tratamentos tambémsão observadas bandas nítidas em igual número epesos moleculares próximos tanto para o materialdialisado como não dialisado.Tabela 1. Peso molecular das proteínas presentes em extratos de peito de galinha orgânicadialisado e não dialisadoFig. 1. Perfil de migração(SDS-PAGE) das proteínasextraídas de peito de galinhaorgânica- material dialisadoFig. 2. Perfil de migração(SDS-PAGE) das proteínasextraídas de peito de galinhaorgânica-material nãodialisado3Obtenção de Padrão de Identidade de Peito de Galinha Atravésde Eletroforese SDS-PAGEExemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria de AlimentosEndereço: Av. das Américas, 29.501 - Guaratiba                23020-470  -  Rio de Janeiro  -  RJFone: (0XX21) 2410-9500Fax: (0XX21) 2410-1090 / 2410-9513Home Page:  http:\\www.ctaa.embrapa.brE-mail:  sac@ctaa.embrapa.br1a edição1a impressão (2005): versão on-linePresidente:  Regina Isabel NogueiraMembros:   Maria da Graça Fichel do Nascimento,Maria Ruth Martins Leão, Neide Botrel Gonçalves,Ronoel Luiz de O. Godoy, Virginia Martins da MattaSupervisor editorial:  Maria Ruth Martins LeãoRevisão de texto: Comitê de PublicaçõesEditoração eletrônica:  André Luis do N. Gomes                                 André Guimarães de SouzaComitê depublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 84Ministério da Agricultura,Pecuária e AbastecimentoCGPE 5410Considerações finaisO método se mostrou  adequado ao tipo de matrizutilizada e também bastante preciso, e, com isto,pôde-se observar bandeamento típico da presença deproteínas miofibrilares majoritárias: subunidade demiosina (216 kDa) e actina (42 kDa). A obtençãodestes padrões de identidade será útil para futurostrabalhos que visem o monitoramento de possíveismodificações das proteínas de peito de galinha emfunção da resposta a variações na formulação derações.Referências BibliográficasCHENG, C. S.; PARRISH JR., F. C. Heat-inducedchanges in myofibrillar proteins of bovine longissimusmuscle. Journal of Food Science, Chicago, v. 44, p.22-24, 1979CRAIG, A.; RITCHIE, H.; MACKIE, I. M. Determiningthe authenticity of raw reformed breaded scampi(Nephrops norvegicus) by electrophoretic tecniques.Food Chemistry, Essex, v. 52, p. 451-454, 1995.KAISER, K. K.; KRAUSE, I. Analytik von Proteinen inLebensmitteln mit elektrophoretischen undchromatographischen Verfahren. Zeitschrift FurLebensmittel-Untersuchung Und Forschung, Berlin, v.180, n. 3, p. 181-201, 1985.LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophage t4.Nature, London, v. 227, p. 680-685, 1970.SGARBIERI, V.C. Alimentação e nutrição: fator desaúde e desenvolvimento. Campinas: Ed. UNICAMP;São Paulo: Almed, 1987SGARBIERI, V.C. Proteínas em alimentos protéicos:propriedades, degradações, modificações. São Paulo:Livraria Varela,1996.

Obtenção de padrão de identidade de peito de galinha através de eletroforese SDS-PAGE.

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Obtenção de padrão de identidade de peito de galinha através de eletroforese SDS-PAGE.

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