Relatar um método para a determinação da atividade de tanase imobilizada covaletemente a suportes inertes insolúveis, adaptado a partir do equivalente para enzima livre.bitstream/CNPAT-2010/9615/1/Ct-110.pd

FERREIRA, A. L. de O.

GONÇALVES, L. R. B.

MELO, A. F.

PINTO, G. A. S.

Relatar um método para a determinação da atividade de tanase imobilizada covaletemente a suportes inertes insolúveis, adaptado a partir do equivalente para enzima livre

Infoteca-e

ISSN 1679-6535Dezembro, 2005Fortaleza, CE1 Graduanda em Engenharia de Alimentos/UFC - Bolsista PIBIC/CNPq/Embrapa Agroindústria Tropical2 Químico Tecnológico, D.Sc., Embrapa Agroindústria Tropical, R. Dra. Sara Mesquita, 2270, Pici, Cep 60511-110, Fortaleza, CE. E-mail: gustavo@cnpat.embrapa.br3 Enga. Química, D.Sc., Profa. Adjunta do Dep. de Engenharia Química da Universidade Federal do Ceará, CE, Caixa Postal 12168, CEP 60356-000, Fortaleza, CE4 Enga. Química, D.Sc., Profa. Visitante do Dep. de Engenharia Química da Universidade Federal do Ceará, CE.Ariana Farias Melo1Gustavo Adolfo Saavedra Pinto2Luciana Rocha Barros Gonçalves3Andrea Lopes de Oliveira Ferreira4Foto: Gustavo Adolfo Saavedra PintoApesar de as enzimas serem excelentes catalisadores, suaaplicação industrial pode ser limitada, devido a diversosfatores, como: custo de produção, alta solubilidade emágua, menor estabilidade, quando comparadas comcatalisadores químicos; baixa atividade a temperaturaselevadas e não ser viável sua recuperação após a utiliza-ção. Por outro lado, a imobilização de enzimas podeminimizar ou até mesmo eliminar alguns fatores limitantesapresentados pelas enzimas livres. Segundo Chibata(1978), enzimas imobilizadas são definidas como enzimasque estão fisicamente confinadas ou localizadas numacerta região do espaço, com retenção de suas atividadescatalíticas e que podem ser utilizadas de forma contínuae/ou repetidas vezes.A aplicação industrial da tanase, ou tanino-acil-hidrolase(E.C. 3.1.1.20), é bastante diversificada,  usada naprodução industrial de ácido gálico, cujo éster é utilizadocomo agente conservante, na indústria de alimentos pararemover certas substâncias indesejáveis, na indústria deração animal e no tratamento de efluentes de curtumes. Naindústria de alimentos, sua maior aplicação é no tratamentode folhas ou extratos de folhas de chá, para reduzir osurgimento de turbidez em bebidas geladas, em virtude dapresença de taninos. A tanase apresenta, também, grandepotencial de aplicação em sucos de frutas tropicais ricosem taninos.Inoue & Hagerman (1988), relatam um método paradeterminação de galotaninos, que envolve a formação deum complexo entre rodanina e ácido gálico, liberado apósuma etapa de hidrólise ácida do tanino. O complexo, quepossui absorbância máxima a 520 nm, resulta da reaçãoda rodanina com os grupos hidroxil vicinais do ácidogálico. As moléculas de rodanina que não reagiram, nãoapresentam, em solução básica, absorbância em compri-mentos de onda superiores a 450 nm. A rodanina apresen-ta baixa ou nenhuma afinidade pelos grupos hidroxil deradicais galoil presentes na estrutura dos taninos. Arodanina também pode reagir, em soluções alcalinas, comquinonas ou hidroquinonas, mas os produtos dessasreações absorvem comprimentos de onda maiores (Thies &Fischer, 1973). Dessa forma, esse método é muito útilpara análises rotineiras, pois apresenta alta especificidade(sem interferência dos compostos vegetais fenólicos),sensibilidade e precisão.Método para Determinaçãoda Atividade de Tanase emDerivados Imobilizados2 Método para Determinação da At ividade de Tanase em Derivados ImobilizadosMateriais necessáriosReagentes  Rodanina P.A. Ácido tânico P.A. Etanol absoluto P.A. Hidróxido de potássio P.A. Ácido acético glacial Acetato de sódio P.A.Equipamentos e materiais Balança analítica e semi-analítica Banho termostático com agitação Placa de agitação Agitador de tubos de ensaio Pipetas graduadas (1, 10 e 20 mL) Tubos de ensaio médios Erlenmeyer de 100 mL Proveta de 50 e 1.000 mL Balão volumétrico de 100 e 1.000 mL Cronômetro digital Espectrofotômetro Cubetas de vidroPreparo de SoluçõesSolução de ácido acético 200 mM (1.000 mL)Diluir 11,6 mL de ácido acético glacial para 1.000 mLcom água destilada em balão volumétrico, homogeneizar etransferir para um frasco de vidro devidamente etiquetado.Armazenar em geladeira por tempo indeterminado.Solução de acetato de sódio 200 mM(1.000 mL)Dissolver 16,4 g de acetado de sódio (C2H3O2Na) ou 27,2 gde acetado de sódio triidratado (C2H3O2Na . 3 H2O) em500 mL de água destilada, transferir para um balão de1.000 mL e completar com água destilada, homogeneizare transferir para um frasco de vidro devidamente etiquetado.Armazenar em geladeira por tempo indeterminado.Tampão acetato 20mM, pH 5,0 (1.000 mL)Misturar 29,6mL da solução de ácido acético 200 mMcom 70,4 mL da solução de acetato de sódio 200 mM ecompletar o volume para 1.000 mL.Armazenar em geladeira por tempo indeterminado.Solução 100 mg/L de ácido gálico(1.000 mL)Pesar em balança analítica 100 mg de ácido gálico; emseguida, dissolver em 200 mL de água destilada sobagitação constante, e transferir analiticamente para umbalão volumétrico 1.000 mL e aferir o volume.Essa solução não pode ser armazenada.Solução de ácido tânico 0,05% em tampãoacetato 20 mM pH 5,0 (100 mL)Pesar em balança analítica 0,05 g de ácido tânico; emseguida, dissolver em 50 mL de tampão acetato 20 mMpH 5,0, transferir para um balão volumétrico 100 mL eaferir o volume.Transferir o conteúdo para frasco de vidro etiquetado earmazenar em geladeira por, no máximo, dois dias.Solução de hidróxido de potássio 0,5 N(100 mL)Utilizando uma balança semi-analítica, pesar 2,8 g dehidróxido de potássio e dissolver em 50 mL de águadestilada. Em seguida, transferir para um balão volumétricode 100 mL e aferir o volume.A solução deve ser transferida para um frasco de plásticoetiquetado, podendo ser armazenada à temperaturaambiente por tempo indeterminado.Solução etanólica de rodanina 0,667%(100 mL)Pesar, em balança analítica, 0,667 g de rodanina P.A. edissolver em 50 mL de etanol absoluto P.A., com auxíliode bastão magnético e placa de agitação. Após totaldissolução da rodanina, transferir para um balãovolumétrico de 100 mL e aferir o volume com etanolabsoluto P.A.A solução deve ser armazenada em geladeira por, nomáximo, 15 dias em frasco de vidro devidamente etiquetado.O método de rodanina foi posteriormente adaptado porSkene & Brooker (1995) e Sharma et al. (2000) paradeterminação da atividade de tanase livre produzida porbactérias e por fungos, respectivamente. Pinto (2003)introduziu algumas modificações, visando a redução novolume de reagentes gastos e a substituição do metanolpor etanol como solvente da rodanina.Contudo, o método de análise da atividade livre não éadequado à quantificação da atividade imobilizada. Dessaforma, este trabalho tem como objetivo relatar um métodopara a determinação da atividade de tanase imobilizadacovalentemente a suportes inertes insolúveis, adaptado apartir do equivalente para enzima livre.3Método para Determinação da At ividade de Tanase em Derivados ImobilizadosSolução de Água Concentraçãoácido gálico destilada final(mL) (mL) (mL)0 9 0 1 02 0 8 0 2 03 0 7 0 3 04 0 6 0 4 05 0 5 0 5 06 0 4 0 6 07 0 3 0 7 08 0 2 0 8 09 0 1 0 9 0100 0 100Tabela 1. Preparo das soluções para curva-padrão.Determinação da absorbânciaTransferir para tubos de ensaios 0,4 mL de cada soluçãopreparada. Adicionar 0,6 mL de solução etanólica derodanina e homogeneizar vigorosamente; após cinco minu-tos, adicionar 0,4 mL da solução de hidróxido de potássio0,5 N homogeneizar e deixar em repouso por 2,5 minutos.Em seguida, adicionar 8,6 mL de água destilada, homoge-neizar vigorosamente e ler em espectrofotômetro a 520 nm.O espectrofotômetro deve ser calibrado com amostra semácido gálico (água destilada).Construção da curvaPlotar, em planilha ou calculadora científica, a absorbânciano eixo Y contra a concentração de ácido gálico (mg/L) noeixo X (Fig. 1). A partir do coeficiente angular da retaajustada, calcula-se o fator de concentração (Eq. 1).Fig. 2. Modelo de gráf ico de curva-padrão.angularCoefFator .1 (Eq. 1)Seqüência de Análise da Atividade doDerivadoEtapa I: Incubação do derivadoEm um erlenmeyer de 100 mL adicionar 20 mL da soluçãode ácido tânico 0,05%; em seguida, colocar no banhotermostático a 50 ºC, adicionar 0,1 g do derivadoimobilizado de tanase e ligar a agitação.A reação deve ser conduzida por 30 minutos.Etapa II: Quantificação do ácido gálicoliberadoA cada cinco minutos (até completar os 30minutos) devem ser retiradas alíquotas de 0,4 mL damistura reacional, transferi-las para os tubos de ensaio,que deverão estar preparados com 0,6 mL de soluçãoetanólica de rodanina, e homogeneizar vigorosamente.Após retirar a última alíquota, deixar reagir por cincominutos. Em seguida, adicionar 0,4 mL da solução dehidróxido de potássio 0,5 N em cada tubo homogeneizare deixar em repouso por 2,5 minutos. Logo após essetempo, adicionar 8,6mL de água destilada, homogeneizarvigorosamente e ler em espectrofotômetro a 520 nm.Etapa III: Cálculo da atividade presente noderivado imobilizadoA partir dos valores experimentalmente obtidos (Tabela 1),plotar, em planilha ou calculadora científica, a absorbânciano eixo Y contra o tempo (em minutos) no eixo X. Emseguida,  determina-se a equação da reta e o coeficientede correlação (R2), onde esse último deve apresentar umvalor acima de 0,95 (Fig. 2).0 0,2373 0,23295 0,3145 0,31971 0 0,4034 0,41671 5 0,4929 0,50892 0 0,6065 0,59202 5 0,6877 0,66733 0 0,7608 0,7768Tempo Absorbância 1 Absorbância 2(minutos)Tabela 2. Exemplo de valores experimentais obtidos paraa análise de atividade imobilizada.Curva-Padrão de Ácido GálicoPreparo das soluçõesA partir da solução padrão de ácido gálico, preparar em balõesvolumétricos de 100 mL, soluções variando a concentração deácido gálico de 10 a 100 mg/L, conforme a Tabela 1.4 Método para Determinação da At ividade de Tanase em Derivados ImobilizadosExemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria TropicalEndereço: Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici,CEP 60511-110 Fortaleza, CEFone: (0xx85) 3299-1800Fax: (0xx85) 3299-1803 / 3299-1833E-mail: negocios@cnpat.embrapa.br1a edição on line: dezembro de 2005Comitê dePublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 110Presidente: Valderi Vieira da SilvaSecretário-Executivo: Marco Aurélio da Rocha MeloMembros: Henriette Monteiro Cordeiro de Azeredo,Marlos Alves Bezerra, Levi de Moura Barros, JoséEdnilson de Oliveira Cabral, Oscarina Maria SilvaAndrade e Francisco Nelsieudes Sombra Oliveira.Supervisor editorial: Marco Aurélio da Rocha MeloRevisão de texto: Maria Emília de Possídio MarquesEditoração eletrônica: Arilo Nobre de OliveiraNormalização bibliográfica: Ana Fátima Costa Pinto.Fig. 2. Modelo de gráf ico para cálculo da at ividade da enzima.O cálculo de atividade do derivado é descrito na Equação 2.massafatorCoefAtiv*1,170* (Eq. 2)Ativ.   Atividade do derivado imobilizado (U/g)Coef.     Coeficiente angularfator      Fator de conversão da curva padrão de ácidogálico (mg/L)170,1  Peso molecular do ácido gálico (u.m.a.)massa   massa do derivadoEtapa IV: Determinação do rendimento deimobilização e da atividade recuperadaA partir da Equação 3, podemos determinar o rendimentoda imobilização, ou seja, o percentual de enzima que foiligada covalentemente ao suporte.100)(Re xAtivAtivAtivndinicialfinalinicial (Eq. 3)Rend.   Rendimento de imobilizaçãoAtiv.inicial   Atividade livre inicial  (U/mL)At ivfinal   Atividade livre final  (U/mL)Depois de determinar a atividade do derivado na etapaanterior, com o auxílio da Equação 4 é possível determinara atividade recuperada da enzima no derivado.(Eq. 4)100__)..(__.. xvolumexAtivAtivmassaxAtivAtivãoimobilizaçfinalinicialderivadorecuperadaAtiv.Recuperada  Atividade recuperada do derivadoimobilizadomassa   massa do derivado imobilizado (g)Ativ.inicial   Atividade livre inicial  (U/mL)Ativ.final   Atividade livre final  (U/mL)Volumeimobilização   volume do meio reacionalReferências BibliográficasCHIBATA, I. Industrial application of immobilized enzyme-systems. Pure and Applied Chemistry. v.50, n.7, p.667-675,1978.SHARMA, S., BHAT, T.K.; DAWRA, R.K. A spectro-photometric method for assay of tannase using rhodanine.Analytical Biochemistry. v. 279, p. 85-89, 2000.SKENE, I.D.; BROOKER, J.D. Characterization of tanninacylhydrolase activity in the ruminal bacteriumSelenomonas ruminantium. Anaerobe, v.1, n.6, p. 321-327,1995.PINTO, G.A.S. Produção de tanase por Aspergillus niger.2003. 209p. Tese (Doutorado em Tecnologia de Proces-sos Químicos e Bioquímicos) - Escola de Química, Univer-sidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.THIES, M.; FISCHER, R. Photometrische bestimmug vongallassäuredurch farbreaktion mit rhodanine. MikrochimicaActa, v.5, p.809-814, 1973.

Método para determinação da atividade de tanase em derivados imobilizados.

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