LIMA, L. H. G. de M.

LIMA, M. M. de A.

MENESES, C. H. S. G.

SILVA, M. V. da

VIDAL, M. S.

Infoteca-e

1Extração de RNA Total de Folhas de AlgodoeiroISSN 0100-6460AutoresMarleide Magalhães de Andrade LimaEng. Flor., D.Sc., da  Embrapa AlgodãoRua Osvaldo Cruz, 1143 – Centenário58107-720 – Campina Grande, PbE:mail: marleide@cnpa.embrapa.brMarcia Soares VidalBióloga, D.Sc., da  Embrapa AgrobiologiaRodovia BR 465, KM 723890-000 – Seropédica, RJE:mail: marcia@cnpab.embrapa.brLeonardo Henrique Guedesde Morais LimaBiólogo, M.Sc., Bolsista do CNPq/Embrapa AlgodãoCarlos Henrique SalvinoGadelha MenesesBiólogo,  M.Sc., Doutorando da UFRJAv. Pedro Calmon, 550Cidade Universitária 21941-901- Rio de Janeiro - RJMárcia Vanusa da Silva Eng. Agrôn., D.Sc., da UFPEAv. Prof  Moraes Rego, 1235Cidade Universitária50670-901 - Recife - PEExtração de RNA Total de Folhas de AlgodoeiroO algodão é um dos produtosagrícolas de maior importânciaeconômica do grupo das fibras,pelo volume e valor daprodução. Seu cultivo é tambémde grande importância social,pelo número de empregos quegera direta ou indiretamente(RICHETTI; MELO FILHO,2001).A busca por cultivares dealgodão tolerantes a diversos tipos de estresses bióticos e abióticos é defundamental importância, face à expressão econômica que a cotoniculturarepresenta em nível mundial.Os métodos inovadores, envolvendo a compreensão da expressão de genesque propiciam a melhoria de genótipos, envolvem, além do seqüenciamentode DNA em larga escala, estratégias para ordenação de seqüências contíguase métodos para  identificação de genes em uma seqüência genômica,culminado na tecnologia da genômica funcional, que engloba estudos detranscriptoma e proteoma. (ARPAT et al., 2004, BRUCE et al., 2002, RONGet al., 2005).O RNA total é utilizado em diversos tipos de análises de expressão gênica ecaracterização de transcritos, baseando-se nos métodos de Northern, RT-PCR, construção de bibliotecas de cDNA e ESTs. Para essas análises, érecomendável a purificação da moléculas de RNA, de maeira que estasestejam intactas e completas, em termos de comprimento, além de puras eíntegras.A principal preocupação na extração de RNA, por ser uma molécula instável,consiste em evitar a sua degradação por ribonucleases (RNases), que sãoenzimas extremamente resistentes a vários tratamentos, inclusive aostérmicos (fervura, autoclavagem). A utilização de agentes desnaturantesfortes permitem a quebra das células e a inativação das ribonucleases. Nométodo básico, a extração é realizada com fenol seguida da precipitação doRNA por etanol. Para diminuir a contaminação por RNAses - das soluções,equipamentos, vidrarias e reagentes -, é recomendável a autoclavagem e/ou otratamento com dietilpirocarbonato (DEPC),  que é um forte inibidor deRNAses.CircularTécnicaCampina Grande, PBOutubro, 20071132 Extração de RNA total de folhas de algodoeiroUm outro fator, que dificulta a obtenção de umRNAtotal de boa qualidade, é a presença de compostosfenólicos no material vegetal. Esses compostos estãopresentes em todos os vegetais e compreendem umgrupo heterogêneo de substâncias, umas com estruturasquímicas relativamente simples e outras,  complexas. Oscompostos fenólicos causam oxidação no produto finalda extração  DNA ou RNA, de forma irreversível,tornando-o inviável para posterior uso nas técnicas debiologia molecular; no algodão, esse problema éagravado pela abundância desses compostos nas suasfolhas.Dentre os tipos de RNA, o mais utilizado em pesquisasde biologia molecular - visando o melhoramento deplantas - é o RNA mensageiro (RNAm), que permitedeterminar onde e quando certo gene está sendoexpresso, para o entendimento posterior da sua função.Uma das estratégias envolvendo estudos com RNAm éa análise da expressão diferenciada de genes emrespostas de tolerância, de resistência ou de fatoresenvolvidos com a interação patógeno-hospedeiro.Após a realização de testes - utilizando váriosprotocolos de extração com a finalidade de neutralizar oefeito oxidativo dos compostos fenólicos presentes nasfolhas de algodão sobre o RNA total -, pode-seestabelecer que o protocolo no qual foi usado oreagente o "Concert™ Plant RNA Reagent" foi o quemelhor atendeu ao objetivo proposto(Fig. 1), cujoprocesso de extração será detalhado a seguir.Folhas jovens medindo, aproximadamente, 2,5 cmforam coletadas e armazenadas em nitrogênio líquido.De cada amostra, 0,1g foi macerado em nitrogêniolíquido com auxílio de pistilos e almofarizes deporcelana previamente resfriados, até torna-se um pófino, que foi transferido para microtubos, aos quais,posteriormente, adicionou-se 0,5 mL de "Concert™ PlantRNA Reagent". O material contido nos microtubos foilentamente misturado e incubado por cinco minutos àtemperatura ambiente, tendo-se o cuidado de deixar osmicrotubos sempre na horizontal, para aumentar asuperfície de contato. Após o período de incubação, omaterial foi centrifugado a 12.000 rpm, por doisminutos, à temperatura ambiente e o sobrenadantetransferido para um novo microtubo. Em seguida,adicionaram-se 0,1 mL de cloreto de sódio (NaCl) 5M e0,3 mL de clorofórmio, em cada tubo, os quais foraminvertidos por dois minutos. Os tubos foramcentrifugados a 12.000 rpm à temperatura de 4 ºC por10 minutos. Os sobrenadantes foram transferidos paranovos tubos, aos quais foi adicionado igual volume deisopropanol gelado. Posteriormente, o material foiincubado por dez minutos à temperatura ambiente ecentrifugado novamente, a 12.000 rpm à temperaturade 4 ºC, por 10 minutos. O precipitado formado foilavado com 1 mL de etanol 75%, centrifugado a12.000 rpm, por 1 minuto; em seguida,  foi mantido àtemperatura ambiente até a sua secagem e novamentemantido em 30 L de água Milli-Q Rnase free. O RNAtotal extraído foi armazenado em um deep freezer àtemperatura de -80 ºC.Para verificar a eficiência do protocolo, foi realizada acorrida do RNA extraído em gel de agarose a 0,8% (p/v), no qual observou-se a presença de bandas,concluindo-se que o protocolo é adequado para extraçãode RNA de folhas de algodoeiro.Fig. 1. Esquema do protocolo de extração utilizando o PlantRNA Reagent.3Extração de RNA Total de Folhas de AlgodoeiroReferências BibliográficasARPAT, A.B.; WAUGH, M.; SULLIVAN, J.P.;GONZALES, M.; FRISCH, D.; MAIN, D.; WOOD, T.;LESLIE, A.; WING, R.A.; WILKINS, T.A. Functionalgenomics of cell elongation in developing cotton fibers.Plant Molecular Biology, Dordrecht, v. 54, n. 6, p.911-929, 2004.BRUCE, W. B.; EDMEADES, G. O.; BARKER, T. C.Molecular and physiological approaches to maizeimprovement for drought tolerance. Journal ofExperimental Botany., Oxford, v. 53, p.13-25, 2002.CircularTécnica, 113Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa AlgodãoRua Osvaldo Cruz, 1143 Centenário, CP 17458107-720 Campina Grande, PBFone: (83) 3315 4300 Fax: (83) 3315 4367e-mail: sac@cnpa.embrapa.br1a EdiçãoTiragem: 500Comitê dePublicaçõesPresidente:  Nair Helena Castro ArrielSecretária Executiva: Nivia Marta Soares GomesMembros:   Demóstenes Marcos Pedroza de Azevedo  Everaldo Paulo de Medeiros  Fábio Aquino de Albuquerque  Francisco das Chagas Vidal Neto  João Luiz da Silva Filho  José Wellingthon dos Santos  Luiz Paulo de Carvalho  Nelson Dias SuassunaExpedientes: Supervisor Editorial: Nivia M.S. GomesRevisão de Texto: Nisia Luciano LeãoTratamento das ilustrações: Oriel Santana BarbosaEditoração Eletrônica: Oriel Santana BarbosaRICHETTI, A., MELO FILHO, G. A. de. Aspectossocioeconômicos do algodoeiro. In: ALGODÃO:tecnologia de produção.  Dourados: EmbrapaAgropecuária Oeste; Campina Grande: EmbrapaAlgodão,  2001. p. 13-34.RONG, J.; BOWERS, J. E.; SCHULZE, S. R.;WAGHMARE, V. N.; ROGERS, C. J.; PIERCE, G. J.;ZHANG, H.; ESTILL, J. C.; PATERSON, A. H.Comparative genomics of Gossypium and Arabidopsis:unraveling the consequences of both ancient and recentpolyploidy. Genome Research, Cold Spring Harbor, v.15, n. 9, p. 1198-1210, 2005.

Extração de RNA total de folhas de algodoeiro.

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