ARAUJO, F. R.

LUÍZ, H. L.

OLIVEIRA, R. H. M. de

PÉRES, I. A. H. F. S.

RAMOS, C. A. do N.

RUSSI, L. dos S.

SOUZA, I. I. F. de

Portuguese

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Avaliação de um Protocolo de Extração de DNA Genômico a Partir de Sangue TotalIntrodução        Com o advento das técnicas de biologia molecu-lar, o diagnóstico de agentes infecciosos evoluiu dramaticamente. A reação em cadeia da enzima DNA polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) (MULLIS, et al., 1987) tem sido aplicada ao diag-nóstico de inúmeros organismos (bactérias, vírus, protozoários) em diferentes espécies animais (MA-DRUGA et al., 2003; KE et al., 2006; CARELLI et al., 2007). Em bovinos, essa técnica possibilitou um diagnóstico mais acurado e o melhor entendimento epidemiológico, por meio da identificação de ani-mais portadores assintomáticos, de muitos agentes infecciosos como, por exemplo, a riquétisia Ana-plasma marginale e os protozoários Babesia bovis e Babesia bigemina (ADHAM et al., 2009; OOSHIRO et al., 2009).ISSN 1983-9731Campo Grande, MSDezembro, 2009TécnicoComunicadoFlábio Ribeiro de Araújo1Carlos Alberto do Nascimento Ramos2Hera Luana Luíz3Igor Alexandre Hany Fuzeta Schabib Péres4Renato Henrique Marçal Oliveira5Ingrid Ieda Fernando de Souza6Lívia dos Santos Russi71 Médico-Veterinário, Ph.D. em Imunologia, pesquisador da Embrapa Gado de Corte, Campo Grande, MS, flabio@cnpgc.embrapa.br2 Médico-Veterinário, M.Sc., aluno do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE, carlosanramos@yahoo.com.br3 Bióloga, aluna do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Campo Grande, MS, heraluana@hotmail.com4 Médico-Veterinário, Aluno do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Campo Grande, MS, igorale_vet@hotmail.com5 Químico, Assistente A, Embrapa Gado de Corte, Campo Grande, MS, renato@cnpgc.embrapa.br6 Bióloga, aluna do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Campo Grande, MS, ingridsbio2005@gmail.com7 Médica-Veterinária, M.Sc., bolsista de Desenvolvimento Tecnológico Industrial DTI Embrpaa/CNPq, Campo Grande, MS, livia_russi@hotmail.com120A PCR consiste na amplificação in vitro de fragmen-tos de DNA delimitados por um par de oligonucle-otídeos iniciadores (primers), pela ação da enzima DNA polimerase, a partir de uma fita molde de DNA. Portanto, o DNA molde é o primeiro fator limitante de uma bem sucedida reação de PCR. Uma grande variedade de métodos estão disponíveis hoje, inclusive comercialmente, para extração de ácidos nucléicos a partir dos mais variados tecidos (sangue, pelos, ossos, etc.), cada um com suas vantagens e desvantagens. Para extração de DNA a partir de sangue total, os kits disponíveis comer-cialmente, em geral, resultam em purificações de boa qualidade para utilização nas mais variadas técnicas moleculares, dentre as quais a PCR. Porém tem como principal desvantagem um alto custo por amostra (em torno de R$ 6,00), maior inclusive do 2 Avaliação de um protocolo de extração de DNA genômico a partir de sangue totalque o custo de uma reação de PCR hoje (em torno de R$ 1,20). Portanto, o objetivo nesse trabalho foi avaliar um protocolo de extração de DNA de sangue total, para utilização principalmente em PCR, rápido, de baixo custo e comparável aos kits comerciais de extração.MetodologiaForam utilizadas 30 amostras frescas de sangue bo-vino (Bos taurus), oriundos de Campo Grande-MS, coletadas com EDTA. Cada amostra foi submetida a extração de DNA com o kit Easy DNA (Invitrogen), conforme metodologia descrita pelo fabricante, e utilizando-se um protocolo in house denominado “Protocolo Embrapa Gado de Corte”, descrito abai-xo:  Protocolo de extração de DNA de amos-tras de sangue “Embrapa Gado de Cor-te”Adicionar 350 • µL de sangue em um tubo de polipro-pileno de 2 mL. Acrescentar 500 • µL de SDS 20%, homogeneizar em vortex e incubar a 65ºC por 6 minutos.Remover o tubo da incubação e adicionar 400 • µL de clorofórmio. Agitar vigorosamente em vortex até completa homogeneização.Acrescentar 300 • µL de solução de precipitação pro-téica e homogeneizar novamente em vortex. Centrifugar a 10.000 x g por 10 minutos.•  Pipetar a fase aquosa e transferi-la para um novo • tubo. Adicionar 1 mL de etanol 100% ou isopropanol, • homogeneizar por inversão e centrifugar a 10.000 x g por 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e acrescentar 1 mL de • etanol 70%. Centrifugar novamente por 2 minutos a 10.000 x g • e desprezar o sobrenadante. Centrifugar novamente por 1 minuto e retirar o resí-• duo de etanol com o auxílio de uma micropipeta. Inverter o tubo para secagem do sedimento (aproxi-• madamente 10 minutos). Adicionar 100 • µL de água livre de nucleases ou tampão TE e homogeneizar lentamente. Incubar a 65ºC por cinco minutos para completa • solubilização do sedimento.Reagentes SDS 20%• SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) – 2 g• H• 2O q.s.p. 10 mL Solução de precipitação protéica• Acetato de Potássio 5 M - 6 mL• Ácido Acético Glacial - 1,1 mL• H• 2O q.s.p. 10 mL Após extração, todas as amostras de DNA foram quantificadas em espectrofotometro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific) e submetidas a eletrofore-se em gel de agarose 0,8% corado com Sybr Gold (Invitrogen) para visualização. As amostras de DNA bovino foram utilizadas em reações de PCR para A. marginale com os primers msp5 F: 5’ CGCAGATCTAGCAAAATCGGCGAGA-GGTTTACCACTTC 3’ e msp5 R: 5’ GCGCTGCAG-TGGCGCAAAATGCCCGACATACC 3’ conforme descrito em Melo et al. (2007).Adicionalmente, 21 amostras de sangue de búfalo (Bubalus bubalis) e 20 amostras de sangue de vea-do-campeiro (Ozotoceros bezoarticus), estocadas a -20ºC, também foram submetidas a extração com o protocolo Embrapa Gado de Corte, quantificadas e visualizadas conforme descrito anteriormente.  As concentrações médias de DNA bovino, assim como as médias da razão A260/A280 ηm foram comparadas pelo teste de t de Student.Resultados e DiscussãoA comparação entre as extrações realizadas com kit comercial Easy DNA e o protocolo Embrapa Gado de Corte está resumida na Tabela 1.Não se observou diferença significativa (P = 0,54) entre as concentrações médias de DNA bovino extraído com as duas metodologias. Os níveis de pureza, representados pela razão entre as absor-bâncias a 260 ηm e 280 ηm, também não diferiram significativamente (P = 0,48).Após eletroforese em gel de agarose, as amostras de DNA de sangue bovino extraídas com o proto-colo Embrapa-CNPGC apresentaram perfil similar às amostras extraídas com kit comercial (Figura 1).3Avaliação de um protocolo de extração de DNA genômico a partir de sangue totalAmostraProtocolo Embrapa Gado de Corte Kit Easy DNAConcentração  ηg/ µL A260/A280 Concentração  ηg/ µL A260/A2801 60,34 1,86 61,35 1,912 13,86 1,91 12,86 1,893 66,02 1,90 65,08 1,804 82,66 1,89 80,06 1,865 101,94 1,87 105,20 1,886 80,82 1,98 80,30 1,967 69,91 1,85 66,96 1,798 93,39 1,97 91,55 1,999 104,86 1,78 103,14 1,8010 75,90 1,77 77,59 1,8011 2,40 1,58 3,60 1,5512 89,56 1,82 90,45 1,7913 18,43 2,06 20,18 1,9914 12,14 2,00 11,56 2,0415 52,71 1,94 46,70 1,9816 118,06 1,89 120,20 1,8417 112,10 1,79 109,56 1,8018 87,69 1,80 85,90 1,7719 68,62 1,86 65,88 1,8920 102,59 1,86 104,36 1,9021 104,80 1,89 108,56 1,8822 99,86 1,94 102,60 1,9623 125,40 2,00 135,20 2,0424 116,58 2,01 119,20 1,8625 79,56 1,79 80,60 1,8826 130,65 1,80 128,56 1,9627 129,36 1,96 134,78 2,0028 112,87 2,05 109,45 1,9829 98,67 1,99 96,50 1,9630 100,89 2,01 105,60 1,80Média 83,75 1,89 84,11 1,88Variação (mín-max) 2,40–130,65 1,58–2,06 3,60–128,56 1,55–2,04Tabela 1. Resultado comparativo das extrações de DNA a partir de sangue bovino realizadas com o protocolo in house Embrapa Gado de Corte e o kit comercial Easy DNA (Invitrogen).Figura 1. Eletroforese em gel de agarose 0,8% das extrações de DNA a partir de 350 µL de sangue de 10 bovinos, utilizan-do-se o protocolo Embrapa Gado de Corte (a) e o kit Easy DNA (Invitrogen) (b).4 Avaliação de um protocolo de extração de DNA genômico a partir de sangue totalAs PCRs para A. marginale realizadas com as amos-tras de DNA bovino extraídas com as duas metodo-logias, detectaram 4 animais positivos entre os 30 analisados (Figura 2).Figura 2. Eletroforese em gel de agarose 1% de PCRs para o gene msp5 de Anaplasma marginale, utilizando-se amostras de DNA extraídas de sangue bovino por meio do protocolo Embrapa Gado de Corte e kit Easy DNA (Invitrogen); 1: Marcador de pares de base 1Kb Plus (Invitrogen); 2-5: PCR realizada com amostras de DNA extraídas seguindo o protocolo Embrapa Gado de Corte; 6-9: PCR realizada com amostras de DNA extraídas com kit Easy DNA.Os resultados de concentração e pureza (A260/280) das amostras de DNA extraídas de sangue de búfa-los e cervídeos podem ser visualizados nas Tabelas 2 e 3 respectivamente.Tabela 2. Resultados da extração de DNA a partir de san-gue de búfalos (Bubalus bubalis) com o protocolo Embra-pa Gado de Corte.AmostraConcentração  ηg/ µLA260/A2801 8,61 1,712 9,81 1,623 14,04 1,284 8,15 1,515 14,56 1,496 23,52 1,807 17,25 1,668 46,12 1,829 49,28 1,8010 7,810 1,3311 6,84 1,6512 16,42 1,7013 8,01 1,4014 27,26 1,7715 16,38 1,5716 31,70 1,8117 44,49 1,8218 50,83 1,9019 30,91 1,7020 38,17 1,7921 41,47 1,81Média 24,36 1,66Variação (mín-max) 6,84 – 50,83 1,28 – 1,90Tabela 3. Resultados da extração de DNA a partir de sangue de veado-campeiro (Ozotoceros bezoarticus) com o protocolo Embrapa Gado de Corte.AmostraConcentração  ηg/ µLA260/A2801 66,24 2,032 66,85 2,113 73,05 1,984 87,30 1,935 75,23 1,896 20,47 1,967 52,90 1,988 55,37 1,89 83,18 2,0010 93,85 1,9011 28,25 1,9112 58,29 1,9913 77,59 1,8714 76,11 1,8515 91,38 1,9616 91,55 2,0517 20,58 1,9018 103,14 1,8819 166,34 1,9420 86,77 2,01Média 73,72 1,94Variação (mín-max) 20,47 – 166,34 1,80 – 2,115Avaliação de um protocolo de extração de DNA genômico a partir de sangue totalExemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Gado de CorteEndereço: Rodovia BR 262, Km 4, Caixa Postal 154, 79002-970 Campo Grande, MSFone: (67) 3368-2083Fax: (67) 3368-2083E-mail: publicacoes@cnpgc.embrapa.br1a ediçãoVersão online (2009)Presidente: Cleber Oliveira Soares Secretário-Executivo: Grácia Maria S. Rosinha Membros: Fabiane Siqueira, Ecila Carolina N. Z. Lima, Elane de Souza Salles, Grácia Maria S. Ro-sinha, Jaqueline Rosemeire Verzignassi, Lucimara Chiari, Paulo Henrique Nogueira Biscola, Roberto Giolo de Almeida, Rodrigo Amorim Barbosa Supervisão editorial: Ecila Carolina N. Zampieri LimaRevisão de texto: Lúcia Helena Paula do Canto Editoração eletrônica: Ecila Carolina N. Zampieri Lima Comitê de publicaçõesExpedienteComunicado Técnico, 120CGPE 8534O protocolo de extração apresentado aqui foi capaz de recuperar DNA a partir de sangue de três diferen-tes espécies ruminantes com concentrações e pu-reza satisfatórias para utilização em PCR, tanto em amostras frescas, quanto em amostras estocadas a -20ºC. O grau de pureza de amostras de DNA é avaliado pela razão entre as absorbâncias a 260 ηm e 280 ηm. Valores inferiores a 1,8 resultam de con-taminação com proteínas, no entanto, valores tão baixos quanto 1,4 ainda são considerados satisfató-rios para utilização em reações de PCR (REGITANO, 2001; LEE et al., 2010).O protocolo de extração Embrapa Gado de Corte mostrou-se também uma metodologia de rápida execução (aproximadamente 30 minutos), compa-rável ao tempo de execução de kits comerciais de extração como Easy DNA – Invitrogen (Manual de Instruções). Outra vantagem do protocolo de extra-ção de DNA apresentado aqui foi seu baixo custo por amostra (em torno de R$ 0,16). ConclusãoO protocolo de extração de DNA genômico de san-gue total Embrapa Gado de Corte mostrou eficiência similar ao kit de extração comercial com sangue total bovino, e foi capaz de extrair DNA com con-centração e pureza satisfatórias a partir de sangue de búfalos e cervos. Portanto, o protocolo aqui apresentado representa uma boa alternativa aos kits comerciais de extração de DNA a partir de sangue. 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R.; ARAÚJO, F. R.; SOARES, C. O.; MELO, E. S. P.; ALMEIDA, D. A.; ALMEIDA JUNIOR, N. F.; XAVIER, M. A. S.; OSÓRIO, A. L. A.; GÓES-CAVALCANTE, G.; RAMOS, C. A. N. Diagnóstico molecular e análise filogenética de islados brasi-leiros de Trypanosoma vivax baseado na reação da polimerase em cadeia – PCR. Campo Grande, MS: Embrapa Gado de Corte, 2003, 5p. (Embrapa Gado de Corte, Comunicado Técnico,  84). MELO, E. S. P.; ARAÚJO, F. R.; RAMOS, C. A. N.; SOARES, C. O.; ROSINHA, G. M. S.; ELISEI, C.; MADRUGA, C. R. ELISA com MSP5 recombinante para detecção de anticorpos contra Anaplas-ma marginale em bovinos. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v. 27, n.7, p.301-306, 2007.MULLIS, K. B.; FALOONA, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzy-mology, New York, v. 155, p. 335-350, 1987. OOSHIRO, M.; ZAKIMI, S.; MATSUKAWA, Y.; YAFUSO, M.; KATAGIRI, Y.; INOKUMA, H. 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Avaliação de um protocolo de extração de DNA genômico a partir de sangue total.

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Avaliação de um protocolo de extração de DNA genômico a partir de sangue total.

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