長崎大学学位論文 学位記番号:博(医歯薬)甲第710号 学位授与年月日:平成26年9月3日Nagasaki University (長崎大学)課程博

Mohamed Elgawish  Mohamed Saleh

長崎大学学位論文 [学位記番号]博（医歯薬）甲第710号 [学位授与年月日]平成26年9月3

Nagasaki University's Academic Output SITE: NAOSITE

 論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨   報告番号   博(医歯薬)甲第 710 号 氏名 Mohamed Saleh Mohamed Elgawish  学 位 審 査 委 員  主 査   黒田 直敬          副 査   中山 守雄          副 査   西田 孝洋           論文審査の結果の要旨   １ 研究目的の評価 本研究は、キノン類の毒性学的研究への適用を目的として、キノン及びその低分子あるいは高分子への付加体の選択的かつ高感度な化学発光定量法の開発を目指したものであり，目的は十分に妥当である。   ２ 研究手法に関する評価 キノンへの紫外線照射あるいは還元により生成する活性酸素を化学発光検出する原理に基づく、マイクロプレート迅速分析法と高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析法を開発した。また、キノンの毒性学的研究を目的として、キノン及びその生体低分子や高分子への付加体の同時分析法を確立し，その性能を解析・評価した研究手法は妥当である。   ３ 解析・考察の評価 確立したマイクロプレート分析法によってキノンの高感度ハイスループット分析が可能となった。また、HPLC システムを用いた分析法では、生体内でキノンにより修飾を受ける生体内の低分子・高分子化合物を特定することができた。これらのキノン付加体もキノンと同様の毒性を持つと考えられ、開発した分析法の臨床検査等への展開が大いに期待される。   以上のように本論文は分析化学研究に貢献するところが大であり、審査委員は全員一致で博士（薬学）の学位に値するものと判断した。   

毒性学的研究を目的とする生体キノン及びその付加体の選択的化学発光検出法の開発

Mohamed Elgawish, Mohamed Saleh

Nagasaki university's Academic Output SITE

Develo（毒性長崎 【はじめに】キける電子伝達られているキ性を有するキ結果として Dサイクルに還元サイクって、生体試響を評価すそこで、本の開発を行生体内で生（１）パルス紫 キノンの示迅速なキノンは、キノンにルへと変化ル誘導体に(Fig. 1)。本キノンへのパ分解蛍光測穴マイクロプ9.4) 及びル9.4) を添加µs から 200た発光量に キノン溶液発光強度がという結果とられる紫外線pment of 学的研究を大学大学院ノンは植物体としてのノンも存在しノンは、DNNA の修飾組み込まれルに伴って料中に存在るために重要研究ではキノった。さらに、じるキノン付外線照射にす特徴的なの新規化学紫外線を照させ、これにより発光検出研究では、測ルス紫外線定が可能なレートのウェミノール誘導した後、プレ0 µs の間について積算すと L-012 溶増大した。本なった。より高の照射波長selective their目的とする医歯薬学や動物の体重要な機能ている。しかA の核酸塩やタンパク質ることで、活発生する Rするキノン及であり、そのンに特徴的開発した方加体の解析へよるキノンの性質を利用発光定量法射することで伴って発生すするという原定操作の省照射とそれプレートリーダルにキノン体 L-012 ートリーダー生じる発光をることにより液を混合した法においてい感度を得は 250 nmchemilum adducts生体キノン総合研究科内に広範囲を有しているし最近では、基やタンパクの構造変化性酸素（ROS は生体成びその生体ためのキノンな性質を利法を生体試料と応用したマイクロプレする高感度の開発を行キノンをセミキる活性酸素理に基づく力化と迅速に続く発光検ーを用いての炭酸緩衝の炭酸緩衝にセットし、波波長 450 nm定量を行ったウェルに対は、p-キノンる目的で各 であり、このinescenc for toxic及びその付生命薬科に見出されて。また、ドキソキノンの有す質のアミノ基をもたらすとOS）を産生分に酸化的成分付加体の高感度か用することでへと応用し。 ートリーダー、簡便かつった。本法ノンラジカをルミノー方法である化のために、出を時間行った。96液溶液(pH 液溶液(pH 長 250 nm において測。 し、パルス紫では強い発光種反応条件波長は用いFig 1. Se assay oological s加体の選択学専攻 いる化合物ルビシンなどる潜在的なやチオールされている。することがな傷害を与の種類や濃つ選択的な、高感度かつ、その実用性/化学発光分 の紫外線を定する。こ外線照射をが得られるの最適化を行たキノンの吸uggested CLf biologictudy    的化学発光Mohamed であり、光合のように医薬毒性が注目基に対して容さらに、キノ知られていえる一因で度を明らかに分析法が必要選択的なキを評価する析 1) パルス照射すの測定操作を行うことによりのに対し、oった。その結収波長とよく mechanismal quinon検出法の開Saleh Elga成や細胞呼品として臨されつつある易に付加反ンは生体内る。このキあると考えすることは、とされていノンの化学とともに、キノる。紫外線100 回繰り、キノン濃度-キノンは発光果、最も高一致してい for quinoneses and 発） wish 吸などにお床的に用い。高い反応応を起こしで酸化還元ノンの酸化られる。従その生体影る。 発光定量法ン暴露後に照射後 500返し、得られに比例してを示さないい発光が得た。したがっ   、 て、キノンが測定発光波酸化分解に各種測定ノン及び メナ範囲で発光出下限 (Bla料あたりの測であることが収率で血清（２）メナジオ 生体内に取結合して付加ROS 発生能変化や毒性加体 (MQ-キノンをジチさせ、これに光検出する応 を 組 み 込MQ-NAC 及化学発光ピピーク高さとによる MQ-(Blank+3SDfmol/injectio開発した 及び MQ-GMQ-NAC 及び MQ-GSMQ-GS と同の安定性やは生体内にを調査するた（３）キノンの紫外線を吸長は L-012 由来するもの条件の最適ジオン (M強度と濃度とnk + 3SD) 定時間は 5明らかとなっ内在成分の影ン及びそのチり込まれた体を生じるを有しておをより詳細にNAC 及び オスレイトーより発生するという原理にん だ  HPLび MQ-GSークを与え、の間に良好NAC, MQ-G) は そ れn であった。HPLC 定量S のピークがび MQ-GS以外にも M様に MQ 可逆性の調存在するキノめに有用で酸化還元サ収することにの発光波長だと考えられ化を行った後Q) ）についの間に相関は 0.01 µM 秒と、他の方た。さらに、響を受けるオール付加キノンは N-アことで無毒化り、キノンと同解析することMQ-GS) とル (DTT) のROS をル基づいていC シ ス テ ム はいずれも5-240 nM な直線性が得S 及び メナぞ れ  1.4 法を、MQ 投検出され、投 が生成したQ 投与後にが付加した生査にも応用すン付加体をあると考えらイクルを利用よりセミキノンである 450 nた。 、本法で高て検量線を作係数 0.999であり、他法法よりも 10-本法をヒト血ことなく、MQ体の高選択セチルシステされると考様な有害作を目的としての同時分析がような化学ミノールによる (Fig. 2)に お い てその濃度の依の濃度範囲でられた。まジオンの検, 0.8 及 び与後のラッ与された Mと考えられたはじめて検出体成分だとることが可能選択的かつ一れる。 する化学発ラジカルへm 付近であい発光を示し成した結果 以上の直線と比較して 3480 倍短く、清中の MQ を測定する的 HPLC イン (NACえられている用をもたらす、代表的な可能な HP的還元剤により化学発。この反、 MQ 、存する濃度とた、本法出下限  128 ト血清試料へQ がラットの。また、ラットされる未知ピ考えられた。であった。以斉に測定す光法によるキと変化していったことからた 3 種のキ、いずれのキ関係が得ら-2000 倍程度本法がキノンの測定へとことが可能で化学発光定) やグルタチ。しかし、ことも報告されキノンであるLC 化学発り還元すると応用した体内に存在血清より得らークが見出さらに本 H上のようにることが可能ノン付加タンFig 2. Redることが示唆、本法で観察ノン（9,10-アノンについてれた。また、本高感度であのハイスルー応用した結果あった。 量法の開発オン (GS) れらのチオーている。そこ MQ とその光定量法のことで、その酸。その結果、する NAC 及れたクロマトされており、PLC 法は、キ、本研究で開であり、これパク質の選ox cycling-bされた。一方される発光ントラキノン、も 0.05-150法におけるった。また、プット分析法、89％以上とラット血漿試といった生体ル付加体はで、生体内で NAC 及び開発を行った化還元サイラット血清よび GS と反グラムには Mこれらが MQノンのチオ発した HPLら付加体の択的解析法 ased CL assaで、最適なは L-012 の1,4-ナフトキ µM の濃度 MQ の検本法の 1 試として有用の良好な回料への応用チオールと依然としてのキノンの GS との付。本法は、クルを誘起り MQ-NAC応することでQ-NAC 及-NAC 及びール付加体C システム毒性や挙動y of quinone2)      キノンとタンれていることかしながら、る。そこで、を行った。最を 行 っ た 。MALDI-TOMQ 未処理により、HSA加えてリジンられた。次にのラット血漿は、ラット血漿選択的に検グラム (Fig.17 分に一種出された。こムのみで検のタンパク質性を有していの同定は現の保持時間ていることが本手法は、する生体試たタンパク質能であり、キ質やその生有用な手法【基礎となる1. M. S. Elga2. M. S. Elg1409. 【参考文献】1. N. Kishikaパク質とのから、キノン複雑な成分(2) と同様に初に、ヒト血MQ 付 加  F-MS 等によの HSA で が発光性を側鎖のアミノ、酸化還元中に存在す中に存在す出される化学 3(B)) では類のタンパの化学発光出されたタンよりも高いキると考えら在進行中でからアルブ示唆されてい多数のタンパ料中からキのみを選択ノン付加タン体影響を調査になり得ると考学術論文】 wish, C. Shimawish, C. Sh wa, M. Naka結合による付付加タンパクより構成されキノンの酸化清アルブミンHSA の 精り行った。調は発光が観示すようにな基に対して サイクル化学る MQ 付加る様々なタ発光クロマト、保持時間約ク質のみが検クロマトグラパク質は、他ノンとの反応れ、その構造あるが、 そミンが含まれる。 ク質が共存ノンが付加し的に検出可パク質の性するためのえている。omai, N. Kisimomai, N. Ko, M. S. Elga加体の生成質の生体内ている生体中還元サイクル (HSA) を製 は 透 析 法製した MQ察されなかっったと考えらMQ が Mi発光反応をタンパク質のンパク質に由 hikawa, K. Oishikawa, K.wish, K. OhyaUV absorbance F(Aは糖尿病やでの存在やから、キノン化学発光MQ とインキに よ り 行 い 付加 HSた。従って、れた。種々chael 付加す組み込んだ解析を試み来するピーhyama, K. N Ohyama, Mma, K. Naka10 ig 3.  Chrom) UV detectTime(A) アルツハイマ生成量を調査付加タンパクを利用するキュベートする、 そ の 構A は本法にMQ が共有の構造解析のることによりゲルろ過 Hた。その結果クが多数検akashima, N. . Wada, N. Kshima, N. Ku20 atogram ofion and (B) C, minー病などのすることは毒質を検出すノン付加タンことにより、 造 確 認 は 吸おいて発光結合を介し結果、Cys3、MQ 付加 PLC システム、UV クロマ出された。一Kuroda, Analuroda, Chemroda, Talanta,RCI  rat plasma L detection. 疾患に関与性学的に興ることは非常パク質の検MQ 付加 H収 ス ペ ク応答を示したて HSA に付4 の遊離チHSA が生成を用いて、トグラム (F方、キノン付yst, 2012, 13 . Res. Toxic 2011, 85, 8010 after 1hr of Time(B)     Rすると考えら味深い。しに困難であ出法の開発SA の調製ト ル 測 定 やのに対し、加することオール基にしたと考えMQ 投与後ig. 3(A)) で加体のみが7, 4802. ol, 2013, 26,9. 20MQ admini, min SA  stration 

長崎大学学位論文 学位記番号:博(医歯薬)甲第710号 学位授与年月日:平成26年9月3

https://nagasaki-u.repo.nii.ac.jp/?action=repository_action_common_download&item_id=5796&item_no=1&attribute_id=70&file_no=1

毒性学的研究を目的とする生体キノン及びその付加体の選択的化学発光検出法の開発

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Nagasaki University's Academic Output SITE: NAOSITE

Nagasaki university's Academic Output SITE

Nagasaki University's Academic Output SITE: NAOSITE

Nagasaki university's Academic Output SITE