A III-a Conferință a Medicilor Legiști din Republica Moldova cu Participare Internațională, Consacrată Aniversării a 65 Ani de la Fondarea Centrului de Medicină Legală , 6 – 8 Octombrie 2016 Chișinău, Republica Moldova, Centrul de Medicină Legală, Chișinău, Republica Moldov

Crețu, Adrian

Institutional Repository in Medical Sciences of Nicolae Testemitanu State University of Medicine and Pharmacy of the Republic of Moldova

187 LA-19 TEHNICI DE GENETICĂ MOLECULARĂ APLICATE ÎN MEDICINA LEGALĂ Adrian Crețu Centrul de Medicină Legală Chișinău, Republica Moldova Principiul identificării genetice a fost elaborat în 1984 de Alec Jeffreys pe baza unor regiuni ale ADN-ului formate din anumite secvenţe care sunt repetate de mai multe ori. Numărul de repetări diferă de la un individ la altul generând un profil genetic sau amprenta genetică unică pentru fiecare individ.  La începutul anilor ‘90 ai secolului trecut, gelul de poliacrilamidă era folosit în mare parte pentru separarea alelelor minisateliților sau microsateliților amplificate prin PCR. De la introducerea analizatorului genetic ABI PRISM 310 în 1996, instrumentele de electroforeza capilară au devenit o platformă dominantă pe care se efectuează şi în prezent analizele genetice judiciare. Cu ajutorul tehnologiilor moderne, cantitatea de ADN necesară pentru analiză poate fi obținută chiar și de la o probă biologică minusculă, care permite identificarea profilului genetic al oricărei persoane.   188  Până în prezent, în Republica Moldova, cercetarea genetică a diferitelor cazuri specifice medicinei legale s-a făcut prin analiza markerilor serologici clasici (grupele sangvine, sistemul HLA, proteinele polimorfe şi enzimele, cercetate prin metode imunologice sau electroforetice).  Analiza moleculară a ADN-ului în problemele medico-legale de identificare a persoanelor şi investigaţii criminalistice este folosită pe larg în toate ţările din Europa şi cele din spaţiul CSI, singura ţară care nu dispune de un laborator de genetică judiciară fiind doar Republica Moldova.   Tehnici molecular-genetice utilizate în laboratoarele de genetică judiciară:  PCR – reacţie de copiere şi amplificare a informaţiei ADN;   Real Time PCR – amplificarea şi cuantificarea ADN-ului în timp real;   Electroforeză în gel – separarea fragmentelor de ADN şi vizualizarea lor utilizând un transiluminator şi un sistem fotodocumentare gel;   Electroforeză capilară – separarea şi analiza fragmentelor de ADN la analizorul genetic automatizat;   Secvenţierea ADN – stabilirea secvenţei de nucleotide.   Reacţia de polimerizare în lanţ (Polymerase Chain Reaction, PCR). Metodă al cărei principiu se bazează pe procesul replicării semiconservative şi prin care se realizează amplificarea selectivă şi rapidă a secvenţelor ţintă ADN (fragmentelor de interes). Metoda a fost dezvoltată în condiții de laborator de Kary Mullis în 1983, laureat al Premiului Nobel pentru chimie (1993). Procedura este simplă, economică şi în întregime automatizată. Pentru tehnica PCR sunt necesare următoarele componente: ADN de amplificat, primeri (oligonucleotide, amorse), ADN-polimeraza (Taq, Smart-Taq), dNTP (dezoxiribonucleotid trifosfaţi): dATP, dCTP, dGTP şi dTTP, soluţie tampon (Mg2+ sau Mn2+, K+) care constituie un PCR-Buffer şi apă ultrapură (H2O nuclease free).  Specificaţiile tehnice de bază ale unui thermocycler utilizat pentru amplificarea ADN-ului în laboratoarele de expertiză genetică judiciară: un grad ridicat de flexibilitate, mod simplu de programare, funcţie de gradient, rampă programabilă, mod de incubare, capac cu încălzire ajustabilă, acurateţea temperaturii ridicată (± 0,2ºC). Blocul universal cu microplaci din aluminiu, argint sau aur. Kiturile pentru markerii STR (short tandem repeats), aplicate în cazurile medico-legale, se bazează pe tehnologia PCR multiplex, adică amplificarea tuturor locilor de interes se face în mod simultan.  Real Time PCR. Pentru a evalua calitatea și cantitatea probelor și pentru a determina spectrul potrivit de input, ADN-ul din probele de caz trebuie cuantificat. Pentru cuantificarea ADN-ului uman într-un caz judiciar este necesar un instrument PCR în timp real pentru estimarea conținutului ADN într-o probă, după parcurgerea etapei de extragere a ADN-ului.  Real Time PCR, este util pentru determinarea:   189  - calitativă: rezultat pozitiv sau negativ; - cantitativă: stabilirea concentraţiei. Deși analiza genotipică bazată pe electroforeza capilară domină în laboratoarele de expertize genetice judiciare din 1996 până în prezent, introducerea tehnologiilor alternative pe piață a debutat relativ recent. Determinarea secvenţei nucleotidice a ADN-ului pentru întreaga genă sau o parte din ea se poate face prin: Secvențierea Sanger (metoda clasică) care foloseşte: dNTPs + ddNTPs marcate cu fluorocromi, electroforeză capilară + detector de fluorescență. Secvențierea de nouă generație. Folosind tehnologia secvenţierii de ultimă generaţie (NGS) cuplată cu analiza bioinformatică avansată, fragmentele secvenţiate sunt asamblate pe baza regiunilor în care se suprapun. Polimorfismul unei singure nucleotide (SNP): tehnică utilizată pentru determinarea variaţiilor unei singure nucleotide la nivel de genom.  Separarea fragmentelor de ADN. Pe baza electroforegramelor obţinute în urma electroforezei capilare la secvenţiator (analizor genetic automatizat) şi procesării datelor într-un soft specializat, se poate elibera concluzia privitor la profilul genetic al unei persoane. După această etapă, pot fi comarate profilele ADN-ului mai multor persoane sau de la obiecte ce conţin material biologic de provinienţă umană.  La modul practic, fiecare companie producătoare de secvenţiatoare (analizoare genetice automatizate), au propriile tehnologii de secvenţiere, cele mai notorii fiind: - Applied Biosystems / Life Technologies; - Roche / 454; - Illumina / Solexa; - Pacific Biosciences; - Promega / Spectrum. Aplicaţiile secvențierii: - Amprentarea genetică, prin identificarea profilului genetic; - ADN ancestral şi informaţii cu privire la apartenenţa etnică sau la originea geografică; - Genomuri individuale; - Variațiile structurale ale ADN-ului; - Identificarea agenţilor infecţioşi; - Analiza regiunilor genomului asociate bolilor; - Cercetare oncologică; - HLA în transplantologie; - Farmacogenomica şi medicina personalizată. Amprentarea genetică (identificarea profilului genetic). La fel ca amprentele digitale, amprentele genetice pot fi folosite pentru identificarea persoanelor. Amprentarea ADN, dezvoltată de către Alec Jeffreys, este metoda folosită în prezent în toată lumea în știința medico-legală: în identificarea polimorfismelor  190  individuale în analiza filiaţiei (testele de paternitate), în criminalistică, identificarea victimelor dezastrelor, disputelor legate de imigrări,… În 1992, Consiliul Europei, a publicat recomandarea cu privire la utilizarea analizelor ADN în reţeaua sistemului judiciar. SUA menține cea mai mare baza de date ADN – CODIS (Combined DNA Index System) – care a fost extinsă pentru a include aproape orice infractor, astfel încât deja în anul 2011 erau înregistrate peste 10 milioane de profiluri ADN.  Baza de date a Marii Britanii, NDAD (the National DNA Database) a fost prima bază de date genetică din lume (implementată în 1995) unde sunt incluse: • profilele genetice a tuturor persoanelor arestate pentru o infracţiune care este înscrisă în cazierul judiciar; • profile genetice ale victimelor; • profile genetice a unor persoane pe bază de voluntariat. Numărul total de probe în baza de date britanică a fost de peste 6 milioane în anul 2011. În 2005, guvernul portughez a propus să se introducă o bază de date ADN pentru întreaga populaţie a Portugaliei, dar după o serie de dezbateri, baza de date a fost introdusă doar pentru infractori. Majoritatea țărilor europene folosesc baza de date CODIS, pentru stocarea profilurilor ADN.  Concluzii. Tehnologia convențională folosită în majoritatea laboratoarelor de expertize generice judiciare se bazează pe separarea şi analiza locilor STR (fragmentelor ADN) în analizoare genetice automatizate de tip electroforeză capilară.  Tehnologiile alternative ca secvențierea de ultimă generaţie (NGS) cuplată cu analiza bioinformatică avansată, sau stabilirea rapidă a profilului ADN ar putea deveni în viitorul apropiat tehnologii dominante în laboratoarele de expertize generice judiciare, potențialul acestora fiind foarte larg.  Avatajul secvenţerii NGS este că simultan se pot analiza loci localizaţi pe cromozomi autozomali, cromozomul Y, cromozomul X şi ADN-ul mitocondrial. Spectrul informaţional obţinut fiind mult mai complex faţă de secvenţierea clasică de tip Sanger. Bibliografie. 1. Butler, J.M. Genetics and genomics of core STR loci used in human identity testing. J. Forensic Sci. 51(2): 253-265, 2006.  2. Dogăroiu Cătălin. Identificarea persoanei în medicina legală. Ed. AIT Laboratories, Bucureşti, 2011. 3. Jeffrey M. Perkel, Peter A. Fung. 2016 Next-Gen Sequencing Buyer's Guide. Posted: August 30, 2016. 4. Norrgard, K. Forensics, DNA fingerprinting, and CODIS. Nature Education 1(1):35, 2008. 5. https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_profiling   191  6. https://www.theguardian.com/science/2009/may/24/dna-fingerprinting-alec-jeffreys  7. https://worldwide.promega.com/products/genetic-identity/analysis/spectrum-ce-system-forensics-paternity/   

Tehnici de genetică moleculară aplicate în medicina legală

http://repository.usmf.md/./bitstream/20.500.12710/3106/1/Tehnici_de_genetica_moleculara_aplicate_in_medicina_legala.pdf

Tehnici de genetică moleculară aplicate în medicina legală

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Institutional Repository in Medical Sciences of Nicolae Testemitanu State University of Medicine and Pharmacy of the Republic of Moldova