În cadrul studiului dat au fost obţinute date preliminare privind ponderea grupurilor de pacienţi cu diferite subtipuri de leucemii acute în lotul specifi c de profi l metilic ADN. Am conchis că moleculele nemetilate de ADN, la nivelul promotorului genei p15, prezintă potenţial de marker molecular-epigenetic al leucemiei acute monoblastice la
om. Pentru prelucrarea statistică a datelor a fost utilizat testul „U-Fisher”, iar valoarea p≤0,1 a fost interpretată ca tendinţă statistică а diferenţelor dintre grupurile comparate

Buruiana, Sanda

Butovscaia, Cristina

Buza, Anastasia

Corcimaru, Ion

Popescu, Victor

Ţîbîrnă, Andrei

Romanian

Bulletin of the Academy of Sciences of Moldova. Medical Science

Buletinul AŞM46UTILITATEA POTENŢIALĂ A PROFILURILOR METILICE ALE ADN PENTRU PROCESUL DE PROMOVARE A MARKERILOR MOLECULAR-EPIGENETICI ÎN DIAGNOSTICUL DIFERENŢIAL  AL  LEUCEMIILOR ACUTE_______________________________________  Victor Popescu, dr. în biologie, cerc. şt. superior, Ion Corcimaru, dr. hab., prof. univ., membru cor., Cristina Butovscaia, cerc. şt., Sanda Buruiană, asist. univ., Anastasia Buza, cerc. şt., Andrei Ţâbârnă, dr. în medicină, asist. univ.USMF „Nicolae Testemiţanu”IntroducereÎn anumite celule ale persoanelor care suferă de cancer au fost inregistrate alterări ale profi lurilor epi-genetice şi genetice [1]. Acestea includ hipometilarea la nivelul întregului genom, hipermetilarea locală a genelor supresoare de tumori sau a genelor respon-sabile de reparaţia ADN, precum şi a genelor inhibi-toare ale metastazării, mutaţii punctiforme (substitu-ţia 5-metilcitozinei cu timina) din insuliţele CpG ale genei p53. În cele mai multe cazuri de cancer la om este sta-bilită producerea unor dereglări în cadrul cascadei ciclina D / retinoblastom (Rb), implicate în reglarea ciclului celular [2]. Cu toate acestea, însă, în neopla-ziile hematologice inactivarea genei Rb este rar întâl-nită [3]. Genele p16 şi p15 sunt gene supresoare în multe tumori solide sau neoplazii hematologice [1]. Aceste gene codifi că proteine inhibitoare ale kinaze-lor ciclin-dependente care, la rândul lor, servesc drept reglatori ai fosforilării proteinei pRb. Gena p15 (denumirea ofi cială – CDKN2B), adi-acentă genei p16 în locusul 9p21, la fel se caracteri-zează adeseori printr-un grad avansat al metilării în neoplazmele hematopoietice umane [1, 4].  Metilarea aberantă a promotorului genei p15 a fost stabilită de unii autori cu ajutorul MSP  în pro-porţie de 58% din cazurile de leucemie mieloidă acu-tă, leucemie limfoblastică acută şi leucemie bifenoti-pică acută [5]. Aceşti autori au identifi cat unele profi -luri metilice ale genei p15, caracteristice pentru cele mai multe subtipuri morfologice care apar în diferite stadii ale diferenţierii şi susţin că metilarea frecventă a genei p15 este un eveniment crucial şi timpuriu în leucemiile acute. Cercetările acestor autori sugerează că metilarea p15 survine în mod universal, de novo, în timpul transformării / progresiei leucemice a pre-cursorilor hematopoietici din linia mieloidă / limfoidă sau în celulele stem primitive, pluripotente. Totuşi, de-ocamdată nu au fost găsite diferenţe semnifi cative între profi lurile metilice ale tumorilor din diferite stadii [6], sugerându-se ideea că alterările epigenetice au loc în stadiile timpurii ale dezvoltării cancerului sau în mo-mentul iniţierii tumorilor. Dereglarea unor căi critice de transducţie a semnalelor moleculare, afl ate sub con-trolul genelor Rb/p16 şi p53/p14/MDM2, sau a altora pot adeseori fi  cauza creşterii neoplazice [1]. Anterior au fost prezentate rezultatele unui stu-diu [7] privind prevalenţele unor profi luri metilice ale promotorului genei p15 la pacienţii cu leucemii acute, potrivit cărora profi lul metilic UM este cel mai frecvent şi constituie 24/33 (72,7%), profi lul metilic UU este reprezentat printr-o proporţie cazuistică mai mică – 9/33 (27,3%), iar profi lul metilic MM lipseşte în rândurile pacienţilor cu leucemii acute.           Scopul studiului a fost stabilirea utilităţii poten-ţiale a profi lurilor metilice ale promotorului genei p15 în procesul de promovare a markerilor molecu-lar-epigenetici de diagnostic diferenţial al leucemiilor acute.Materialul şi metodele utilizate În acest studiu a fost investigat un lot din 33 de persoane afectate de leucemii acute (diverse varian-te), fi ind anterior diagnosticate primar şi internate la Centrul Hematologic al Institutului Oncologic din Republica Moldova.Medoda de bază utilizată în cercetarea dată a fost evidenţierea metilării acidului dezoxiribonucleic (ADN) la nivelul promotorului genei p15 prin trata-rea ADN cu bisulfi t de sodiu (conversia citozinei ne-metilate în uracil) şi amplifi carea porţiunilor genice cu ajutorul perechilor de primeri nonmetil-specifi ci şi metil-specifi ci prin tehnica MSP (Methylation Speci-fi c Polymerase Chain Reaction) [8]. Detaliat, metodele şi accesoriile utilizate în pro-iect au fost specifi ce fi ecărei etape de lucru, după cum urmează: recoltarea sângelui venos la pacienţii diagnosticati în prealabil cu diverse subtipuri de le-ucemie acută în eprubete cu anticoagulant K3EDTA; extracţia ADN genomic uman din sânge (Protocol „Qiagen Blood Mini”) [9]; modifi carea ADN-ului prin conversia citozinei în uracil (Protocol „Qiagen EpiTect Bisulfi te Kit”) [10]; amplifi carea prin tehnica MSP a ADN-ului conţinând uracil a fost îndeplinită cu termocycler Crocodile III Appligene (Protocol „PCR Fermentas”) şi primeri [12, 7] sintetizaţi de compania „Alpha DNA”; analiza produşilor de amplifi care a fost efectuată cu aparatul pentru electroforeză orizon-tală „Ultra Gel XL V2” în gel de agaroză „Amresco”, tip I (2,0%) în soluţie TBE (tris-borat-etilendiaminte-traacetat) (1×), marker ADN pentru greutatea mole-47Ştiinţe  Medicaleculară 98 pb (perechi de nucleotide) şi 95 pb; vizua-lizarea produşilor de amplifi care prin transiluminare (312 nanometri) şi documentarea prin fotografi ere. Pentru prelucrarea statistică a datelor a fost utili-zat testul „U-Fisher” (destinat evaluării loturilor mici de subiecţi investigaţi).  Valoarea p<0,005 a fost con-siderată indicator al diferenţei statistic semnifi cative între grupele comparate, iar valoarea p≤0,1 a fost in-terpretată ca tendinţă statistic semnifi cativă.  Rezultate şi discuţiiPentru a putea avansa în elaborarea şi implemen-tarea unui marker ADN metil-specifi c candidat în di-agnosticul diferenţial al leucemiilor acute, este minim necesar ca în urma investigaţiilor molecular-geneti-ce o genă sau un sector al moleculei de ADN să fi e reprezentat prin grupări metilice la nivelul citozinei (atomul de carbon 5) sau a altor baze azotate, care se supun detecţiei cu ajutorul tehnologiei MSP sau prin alte procedee [11]. În afară de aceste principii, este evident că pro-fi lul metilic (UU, UM, MM) prin care se evidenţia-ză starea nemetilată sau metilată a celor două alele de referinţă este necesar să coreleze cu specimenele analizate care provin de la persoane cu diagnosticul patologiei, în cazul dat – cu leucemii acute, dacă se propune evidenţierea markerilor molecular-genetici pentru diagnosticul maladiilor ce ţin de o specialitate medicală sau dacă se urmăreşte evidenţierea markeri-lor molecular-genetici pentru diagnosticul diferenţial pe subtipuri, aceste corelaţii vor fi  estimate în raport cu subtipurile maladiei.În cele ce urmează, prezentăm datele obţinute în urma investigaţiilor unui lot din 33 de persoane afectate de leucemii acute (diverse subtipuri), fi ind anterior diagnosticate primar şi internate în Centrul Hematologic al Institutului Oncologic din Republica Moldova (vezi tabelul).Figura 1. Structura primară a promotorului genei p15 şi localizarea secvenţelor lui complementare cu primerii U şi M. Structura lotului de pacienţi cu leucemie acută pe profi luri metilice ale ADN şi subtipuri ale maladieiNr. d/oSubtipuri de leucemie acută (LA)Profi l UU Profi l UM Profi l MM p OR CI (95%)1. LA eritroblastică Număr 0 1 0 - - -% 0 4,2 0 - - -2. LA limfoblastică Număr 2 7 0 >0,1 0,701 0,057-5,135% 22,2 29,2 0 - - -3. LA megacarioblastică Număr 1 0 0 - - -% 11,1 0 0 - - -4. LA mieloblastică Număr 1 4 0 >0,1 0,633 0,011-7,85% 11,1 16,7 0 - - -5. LA mielomonoblastică Număr 1 5 0 >0,1 0,485 0,009-5,456% 11,1 20,8 0 - - -6. LA monoblastică Număr 3 2 0 =0,1 5,153 0,478-75,162% 30 8,3 0 - - -7. LA nediferenţiată Număr 0 1 0 - - -% 0 4,2 0 - - -8. LA promielocitară Număr 1 4 0 >0,1 0,633 0,011-7,85% 11,1 16,7 0 - - -Total Număr 9 24 0 -33% 27,3 72,7 0Buletinul AŞM48Aceste date relevă următoarele fenomene în rân-durile pacienţilor cu leucemii acute eritroblastice, limfoblastice, megacarioblastice, mieloblastice, mie-lomonoblastice, monoblastice, nediferenţiate şi pro-mielocitare: 1) În acest lot, la nivelul promotorului genei p15, profi lul metilic UM are frecvenţa cea mai înaltă şi constituie 24/33 (72,7%); 2) profi lul metilic UU este reprezentat printr-o proporţie cazuistică mai mică – 9/33 (27,3%); 3) profi lul metilic MM lipseşte [7].Dacă analizăm proporţiile pacienţilor cu profi l UM din numărul total al bolnavilor cu un subtip sau altul al leucemiei acute, găsim că ele sunt diferite. În cea mai mare proporţie profi lul UM se înregistrează printre pacienţii cu leucemie acută eritroblastică şi nediferenţiată – câte 1/1 (100%) fi ecare, după care urmează proporţia celor cu leucemie acută mielomo-noblastică – 5/6 (83,3%), LA mieloblastică şi LA pro-mielocitară – câte 4/5 (80%) fi ecare, LA limfoblastică – 7/9 (77,8%), LA monoblastică – 2/5 (40%). În numărul total al pacienţilor cu leucemii acute, profi l UU (semnifi că lipsa oricăror molecule meti-late de ADN la nivelul promotorului genei p15 din specimenul procesat) (fi gura 2), găsim că predomină bolnavii cu leucemie acută monoblastică – 3/9 (30%) şi pacienţii cu leucemie acută limfoblastică – 2/9 (22,2%), iar cei cu leucemii acute megacarioblastică, mieloblastică, mielomonoblastică şi promielocitară au aceeaşi pondere, egală cu 1/9 (11,1%). De aici rezultă că moleculele metilate de ADN, la nivelul promotorului genei p15, prezintă potenţial diagnostic în calitate de marker molecular-epigenetic al leucemiei acute monoblastice.În numărul total al pacienţilor cu leucemii acute, profi l UM (semnifi că metilarea la nivelul promotoru-lui genei p15 cel puţin a unei molecule de ADN din specimenul procesat) (fi gura 3), predomină pacien-ţii cu leucemie acută limfoblastică, constituind 7/24 (29,2%), după care urmează bolnavii cu leucemie acută mielomonoblastică – 5/24 (20,8%), leucemie acută mieloblastică şi promielocitară – câte 4/24 (16,7%), leucemie acută monoblastică – 2/24 (8,3%) şi, în măsură egală, pacienţii cu leucemii acute eritro-blastică şi nediferenţiată – 1/24 (4,2%). De aici rezultă că moleculele metilate de ADN, la nivelul promotorului genei p15, prezintă potenţial diagnostic în calitate de marker molecular-epigenetic al leucemiei acute mielomonoblastice, mieloblastice, promielocitare, nediferenţiate şi eritroblastice, dar cu condiţia investigării ulterioare a minim 100 de paci-enţi.               Concluzii:1. Moleculele nemetilate de ADN, la nivelul pro-motorului genei p15, prezintă potenţial de marker molecular-epigenetic al leucemiei acute monoblasti-ce. 2. Datele obţinute în acest studiu sunt prelimina-re privind ponderea grupelor de pacienţi cu diferite Figura 2. Ponderea grupurilor de pacienţi pe subtipuri de leucemie acută în lotul de profi l UU.Figura 3. Ponderea grupurilor de pacienţi pe subtipuri de leucemie acută în lotul de profi l UM.49Ştiinţe  Medicalesubtipuri de leucemii acute în lotul specifi c de pro-fi l metilic ADN, iar completarea lotului cu un număr mai mare de subiecţi investigaţi ar oferi posibilitatea validării statistice a lor.   Bibliografi e1. Wong I., Methylation profi ling of human cancers in blood: molecular monitoring and prognostication (Re-view). International Journal of Oncology, 2001; 19: 1319-1324.2. Ewen M., Sluss H., Sherr C., Matsushime H., Kato J., Livingston D., Functional interactions of the retinoblas-toma protein with mammalian D-type cyclins. 1993; Cell 73: 487-497.3. Hangaishi A., Inactivation of multiple tumor-sup-pressor genes involved in negative regulation of the cell cycle, MTS1/p16INK4A/CDKN2, MTS2/p15INK4B, p53, and Rb genes in primary lymphoid malignancies. Blood, 1996; 87: 4949-4958.4. Gronbaek K., Nedergaard T., Andersen M. et al., Concurrent disruption of cell cycle associated genes in mantle cell lymphoma: a genotypic and phenotypic study of cyclin D1, p16, p15, p53 and pRb. Leukemia, 1998; 12: 1266-1271. 5. Wong I., Ng M., Huang, D., Lee J., Aberrant p15 promoter methylation in adult and childhood acute leuke-mias of nearly all the morphologic subtypes: potential pro-gnostic implications. Blood, 2000; 95: 1942-1949.6. Costello J., Fruhwald M., Smiraglia D., Rush L., Robertson G. et al., Aberrant CpG-island methylation has non-random and tumour-type-specifi c patterns. Nat. Ge-net., 2000; 24: 132–138.7. Popescu V., Corcimaru I., Butovscaia C., Zuieva A., Buruiană S., Simionică E., Prevalenţele unor profi luri me-tilice ale promotorului genei p15 la persoane sănătoase şi printre pacienţii cu leucemii acute. Anale Ştiinţifi ce ale USMF „Nicolae Testemiţanu”. 2009; 3, p. 236-243.8. Herman J., Methylation-specifi c PCR: A novel PCR assay for metylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 93: 9821-9826. 9. Protocol QIAGEN (02/2003) – DNA Blood Mini Kit (50).10. Protocol QIAGEN (04/2006) – EpiTect Bisulfi te Kit (48).11. Sepulveda A., Jones D., Ogino S. et al., CpG Me-thylation Analysis-Current Status of Clinical Assays and Potential Applications in Molecular Diagnostics. Journal of Molecular Diagnostics. 2009; 11(4):266-278.12. http://www.ncbi.nlm.nih.gov (Codul de identifi ca-re a secvenţelor NC_000009.11).RezumatÎn cadrul studiului dat au fost obţinute date preliminare privind ponderea grupurilor de pacienţi cu diferite subtipuri de leucemii acute în lotul specifi c de profi l metilic ADN.   Am conchis că moleculele nemetilate de ADN, la ni-velul promotorului genei p15, prezintă potenţial de marker molecular-epigenetic al leucemiei acute monoblastice la om. Pentru prelucrarea statistică a datelor a fost utilizat tes-tul „U-Fisher”, iar valoarea p≤0,1 a fost interpretată ca ten-dinţă statistică а diferenţelor dintre grupurile comparate. SummaryIn this study we have obtained preliminary results on the frequences of various subtypes of acute leukemia with their specifi c DNA methylation profi le. We concluded that unmethylated DNA molecules within p15 gene promoter have potential as molecular-epigenetic marker for acute monoblastic leukemia in human. Statistics were performed with „U-Fisher” test and p≤0,1 was considered as tendency for differences between compared groups.       РезюмеВ данной статье мы представляем предваритель-ные результаты частот разных форм острой лейкемии и профили метилирования ДНК при них.Мы вывели, что неметилированные молекулы ДНК в промоторе гена p15 представляют потенциал в каче-стве молекулярно-эпигенетического маркерa при мо-нобластной лейкемии у человека. Для статистической обработки данных мы использовали „U-Fisher” тест и p≤0,1 был принят как показатель тенденции различий между сравниваемыми гуппами.  Această lucrare a fost realizată сu susţinerea fi nan-ciară a Consiliului Suprem pentru Ştiinţă şi Dezvoltare Tehnologică al Academiei de Ştiinţe a Moldovei, proiec-te înregistrate cu nr. 87.IND din 09.01.2007; 220.IND din 19.01.2009 în Registrul de Stat. EXPRESIA FACTORULUI DE CREŞTERE A ENDOTELIULUI VASCULAR (VEGF) ŞI  A RECEPTORULUI LUI (VEGFR2) ÎN PROCESUL PROGRESIEI NEOPLAZIEI DE CERVIX UTERIN_______________________________________Lilian Şaptefraţi, dr. hab. în medicină, conf. univ., Vitalie Mazuru, asist. univ.; Lucian Rudico, asist. univ.; Valeriu David, dr. în medicină, conf. univ., Tatiana Globa, asist. univ.USMF „Nicolae Testemiţanu”IntroducereIn anul 1863, Virchow R. [12] observă intraope-rator şi semnalează în lucrarea sa “Die Krankhaften Geschwulste” vascularizarea abundentă şi hiperemia vaselor peri- şi intratumorale. Faptul a fost explicat drept o simplă dilatare vasculară în jurul tumorii, care se datora metaboliţilor eliberaţi de celulele necroti-

Utilitatea potenţială a profilurilor metilice ale ADN pentru procesul de promovare a markerilor molecularepigenetici în diagnosticul diferenţial al leucemiilor acute

https://bulmed.md/bulmed/article/download/1473/1473

Utilitatea potenţială a profilurilor metilice ale ADN pentru procesul de promovare a markerilor molecularepigenetici în diagnosticul diferenţial al leucemiilor acute

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Bulletin of the Academy of Sciences of Moldova. Medical Science