La present tesi doctoral descriu la configuració del complex proteic de BRAVO en el nínxol de cèl·lules mare d'Arabidopsis. També demostra que BRAVO-WOX5-BES1 formen part d'una xarxa organitzadora que comprèn heterodímeros de BRAVO-WOX5, i que junts mantenen la quiescencia en els nínxols de cèl·lules mare de l'arrel. I tot això està controlat pels BRs. Aquestes dades proporcionen nous coneixements sobre l'organització de la divisió del centre quiescente en les arrels vegetals. Es va investigar la composició del complex proteic BRAVO de l'arrel primària d'Arabidopsis in vivo mitjançant tècniques de InmunoPrecipitación i cromatografia líquida/masses. Però a causa de la baixa expressió nativa de BRAVO, ens vam veure obligats a realitzar un examen exhaustiu dels possibles interactores de BRAVO en llevat, per a aconseguir augmentar la sensibilitat del nostre enfocament. Les anàlisis van revelar que BRAVO, un membre de la família R2R3 MYB, interactua amb una proteïna de la superfamília homeobox.
Aquest treball demostra que BRAVO, a més d'interaccionar amb WOX5, també ho fa amb BES1 i TPL. El resultat va ser confirmat mitjançant tècniques moleculars in vitro per assajos de Y2H i també in vivo utilitzant FRET-FLIM i BiFC en fulles de Nicotiana benthamiana. Les nostres dades proporcionen evidències d'interacció directa de BRAVO amb WOX5, i al mateix temps, proposem que tots dos podrien formar part del complex transcripcional BES1/TPL en el SCN, i tot això regulat mitjançant BRs. Vam mostrar que la interacció de BES1-TPL és essencial per a la divisió del QC en el nínxol de cèl·lules mare de l'arrel. L'augment dels nivells de BR indueix la divisió del QC mitjançant un mecanisme controlat amb precisió per BRAVO. Els resultats estableixen que TPL regula la divisió de cèl·lules del QC a través de la supressió mediada per BES1 de BRAVO, i en resposta als BRs. A més, mitjançant una anàlisi genètic i matemàtic revelem que la interacció de BRAVO i WOX5 és essencial per a determinar el destí de les cèl·lules mare. De particular interès és el fet que BRAVO i WOX5 es reforcen mútuament en el nínxol de cèl·lules mare d'arrel. Això és sorprenent, ja que els nivells de WOX5 estan regulats per BRs de manera oposada que ho són en BRAVO. Un anàlisi exhaustiu del patró d'expressió de tots dos gens en els mutants KO simples i dobles, secunda que BRAVO és necessari per a mantenir els nivells normals de WOX5 en el QC. A més, les nostres dades són coherents amb el fet que WOX5 pot induir l'expressió de BRAVO, però només en el seu domini natiu. D'acord amb la nostra hipòtesi, el nostre model matemàtic prediu que WOX5 es reprimeix transcripcionalmente i al mateix temps activa l'expressió de BRAVO, tenint en compte la formació de heterodímeros i del complex. En aquest escenari, les interaccions del model indiquen que BRAVO no pot activar l'expressió WOX5 fora del seu domini, d'acord amb els resultats. Vam mostrar una xarxa reguladora de les nostres interaccions predita pel model matemàtic. A més, en augmentar la concentració de BR observem una major correlació entre les concentracions de proteïnes BRAVO i WOX5 quan un d'ells està absent, però no quan falten tots dos. Aquest mecanisme podria ser un mecanisme de compensació. I finalment, en l'últim capítol, aprofundim en l'evolució de BRAVO i de WOX5 amb l'objectiu de comprendre l'organització primitiva i la funció del nostre SCN actual en l'arrel.La presente tesis doctoral describe la configuración del complejo proteico de BRAVO en el nicho de células madre de Arabidopsis. También demuestra que BRAVO-WOX5-BES1 forman parte de una red organizadora que comprende heterodímeros de BRAVO-WOX5, y que juntos mantienen la quiescencia en los nichos de células madre de la raíz. Y todo esto está controlado por los BRs. Estos datos proporcionan nuevos conocimientos sobre la organización de la división del centro quiescente en las raíces vegetales. Se investigó la composición del complejo proteico BRAVO de la raíz primaria de Arabidopsis in vivo mediante técnicas de Inmuno-precipitación y cromatografía líquida/masas. Pero debido a la baja expresión nativa de BRAVO, nos vimos obligados a realizar un examen exhaustivo de los posibles interactores de BRAVO en levadura, para conseguir aumentar la sensibilidad de nuestro enfoque. Los análisis revelaron que BRAVO, un miembro de la familia R2R3 MYB, interactúa con una proteína de la superfamilia homeobox.
Este trabajo demuestra que BRAVO, además de interaccionar con WOX5, también lo hace con BES1 y TPL. El resultado fue confirmado mediante técnicas moleculares in vitro por ensayos de Y2H y también in vivo utilizando FRET-FLIM y BiFC en hojas de Nicotiana benthamiana. Nuestros datos proporcionan evidencias de interacción directa de BRAVO con WOX5, y al mismo tiempo, proponemos que ambos podrían formar parte del complejo transcripcional BES1/TPL en el SCN, y todo esto regulado mediante BRs. Mostramos que la interacción de BES1-TPL es esencial para la división del QC en el nicho de células madre de la raíz. El aumento de los niveles de BR induce la división del QC mediante un mecanismo controlado con precisión por BRAVO. Los resultados establecen que TPL regula la división de células del QC a través de la supresión mediada por BES1 de BRAVO, y en respuesta a los BRs. Además, mediante un análisis genético y matemático revelamos que la interacción de BRAVO y WOX5 es esencial para determinar el destino de las células madre. De particular interés es el hecho de que BRAVO y WOX5 se refuerzan mutuamente en el nicho de células madre de raíz. Esto es sorprendente, ya que los niveles de WOX5 están regulados por BRs de forma opuesta que lo son en BRAVO. Un análisis exhaustivo del patrón de expresión de ambos genes en los mutantes KO simples y dobles, apoya que BRAVO es necesario para mantener los niveles normales de WOX5 en el QC. Además, nuestros datos son coherentes con el hecho de que WOX5 puede inducir la expresión de BRAVO, pero sólo en su dominio nativo. De acuerdo con nuestra hipótesis, nuestro modelo matemático predice que WOX5 se reprime transcripcionalmente y a su vez activa la expresión BRAVO, teniendo en cuenta la formación de heterodímeros y del complejo. En este escenario, las interacciones del modelo indican que BRAVO no puede activar la expresión WOX5 fuera de su dominio, de acuerdo con los resultados. Mostramos una red reguladora de nuestras interacciones predicha por el modelo matemático. Además, al aumentar la concentración de BR observamos una mayor correlación entre las concentraciones de proteínas BRAVO y WOX5 cuando uno de ellos está ausente. Pero no cuando faltan ambos. Este mecanismo podría ser un mecanismo de compensación. Y finalmente, en el último capítulo, profundizamos en la evolución de BRAVO y de WOX5 con el objetivo de comprender la organización primitiva y la función de nuestro SCN actual en la raíz.The present PhD thesis dissertation describes the configuration of BRAVO protein complex in Arabidopsis stem cell niche, while demonstrates that BRAVO-WOX5-BES1 are part of a main regulator network that comprises BRAVO-WOX5 heterodimers, and together contribute to cell specific regulation of BR-controlled quiescence in root stem cell niches.
The current data provide new insights into the QC division organization in plant roots. It was investigated the composition of BRAVO protein complex from Arabidopsis primary root in vivo by IP and LC-MS/MS techniques. Giving the low expression of native BRAVO, we conducted an exhaustive screening for BRAVO interactors in Yeast to increase the sensitivity of our approach. The analyses revealed that BRAVO, a member of the R2R3 MYB family, interact with a homeobox superfamily protein. The work further demonstrate that BRAVO interacts with WOX5, BES1 and TPL. This result was confirmed by molecular techniques in vitro by Y2H assays and in vivo using FRET-FLIM and BiFC in Nicotiana benthamiana leaves. Our data provides evidences of BRAVO directly interaction with WOX5, and at the same time both could be part of the BES1/TPL transcriptional complex at the SCN trough the BR signalling cascade. We display that the interaction of BES1-TPL is essential for the QC division in root SCN. Increasing BR levels induce QC division through a fine mechanism which is accurately controlled by BRAVO. The results establish that TPL regulates QC cell division through BES1-mediated suppression of BRAVO, and in response to BRs, the last step seems to be the promotion of the QC division. By a genetical and a mathematical analysis, we revealed that BRAVO and WOX5 interaction is essential for stem cell fate. Of particular interest is the fact that BRAVO and WOX5 reinforce each other at the root stem cell niche. This was surprising, since WOX5 levels are oppositely regulated by BRs than in BRAVO. The exhaustive analysis of the expression pattern of both genes in all the simple and double KO mutants, support that BRAVO is required to maintain normal WOX5 levels in the QC. In addition our data are coherent with the fact that WOX5 can induce BRAVO expression but only in the BRAVO native domain. Consistent with our hypothesis, a mathematical model predicted that WOX5 transcriptionally represses itself and activates BRAVO expression, taking in account the heterodimers and complex formation. In this scenario, the model interactions indicate that BRAVO is unable to activate WOX5 expression outside of its domain, in agreement with the results of the BRAVO overexpression line. We show a regulatory network of our interactions predicted by the mathematical model. We added the protein fold changes predicted by this model when changing the BR concentrations due to the BR signalling cascade in different situations and we observed better correlation of BRAVO and WOX5 protein concentrations when one of them are absent. But not when both are out. The exact reasons for these differences are not clear. This mechanism could be a compensation mechanism. And finally, in the last chapter, we delve into evolution with the aim to comprehend the primitive organisation and function of our present root SCN.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biologia i Biotecnologia Vegeta
