Batista, Jacqueline da Silva

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Repositório do INPA

VII Jornada de Iniciação Científica do INPA • 07 a 09 de Julho de 1998 • Manaus - AMVER-002MONTAGEM DE UM BANCO DE DNA PARA PEIXES DAS ORDENS GYMNOTIFORMES ESILURIFORMES NO INPA.Jacqueline da Silva Batista (I); José Antônio Alves Gomes (2)Bolsista CNPq/PIBIC (I); Pesquisador INP A/CPBA (2)o DNA (ácido desoxiribonucleico) é a molécula da hereditariedade em todos os organismosprocarióticos e eucarióticos (STRYER,1981) e por ser o reservatório de informações genéticas dosorganismos, ocupa uma posição única e central entre as macromoléculas biológicas. As seqüênciasnucleotídicas do DNA, em última análise, determinam as estruturas primárias de 'todos os RNAs,proteínas celulares e enzimas, podendo direta ou indiretamente afetar a síntese de todos os constituintescelulares, determinando o tamanho, a forma e a função dos tecidos dos seres vivos (LEHNINGER, 1995).Segundo BEIGUELMAN (1982) o DNA é, quimicamente, um polissacarídeo, isto é um polímero denuc1eotídeo, os quais podem ser liberados por hidrólise catalisada por enzimas. Cada nuc1eotídeo éconstituindo além de outros compostos de uma base nitrogenada de purina ou de pirimidina. A basepúrica é a adenina e guanina, enquanto a base pirirnídica é a citosina e a timina. A figura 01 mostra amolécula de DNA com as quatro bases pareadas. Segundo LEHNINGER, (1995) os nuc1eotídeos sãocompostos ricos em energia que direcionam os processos metabólicos (principalmente as biossínteses)em todas as células. Os genes de todas as células são feitos de DNA que possui duas cadeiaspolinucleotídicas helicoidais enroladas em tomo de um eixo comum. Essas moléculas são muito longasafim de que seja codificado um grande número de proteínas necessárias ao metabolismo dos seres vivos(STRYER,1988).Considerando-se que as Ordens Gymnotiformes (peixes elétricos) e Siluriformes (bagres), além deserem considerados grupos irmãos (FINK AND FINK, 1981) - ou seja, essas duas ordens de peixespossuem um ancestral comum que não é dividido com mais nenhum outro grupo de peixes -, elasperfazem um percentual significativo da ictiofauna amazônica. Em função disso, estas ordens têm valoracadêmico muito importante em diversas áreas de pesquisas que também estudam, segundo MOLLER,(1995) a evolução do órgão elétrico das espécies da ordem Gymnotiformes e a eletroreceptividade dasespécies da ordem Siluriforme. Estudos moleculares poderão auxiliar de uma maneira fundamental oentendimento de vários aspectos da biologia destes grupos. A base de qualquer estudo genético-molecularestá na extração e preservação do DNA das espécies em estudo. A montagem de um banco de DNA é decrítica importância para futuros estudos que incluam a utilização de qualquer porção de Genoma dasespécies das ordens citadas.Este projeto teve o objetivo de criar, no laboratório de biologia molecular do INPA, um banco dedados que contenha o DNA extraído do maior número de espécies possíveis das ordens Gymnotiformes eSiluriformes, para que este banco sirva como fonte de material para estudos futuros na área genético-molecular destas ordens de peixes.Os Espécimes das ordens Gymnotiformes e Siluriformes foram coletados em excursões de campopróprias do projeto em vários locais da Amazônia como Tarumã, Catalão, ilha da Marchantaria e Lago doJanauacá com o auxilio de aparelho detecto r de peixe elétrico, redes e puçás de malha inferior a 1 em.Outros foram coletados por colegas de outros projetos. Os espécimens foram preservados em álcool 70%.O material coletado foi identificado com auxílio de chaves taxonômicas disponíveis e com o auxílio deespecialistas. Após a identificação de cada indivíduo, uma amostra de tecido foi retirada e o espécimenfoi depositado como testemunho na coleção de peixes do INP A.O DNA foi extraído através de técnicas padronizadas descritas em Alves-Gomes et ai 1995. ODNA total (mitocondrial + genômico) foi extraído com um tampão à base de SDS na presença deproteinase K e RNAse e purificado através de duas extrações com fenol equilibrado, duas comfenol/clorofórmio/álcool isoarrulico (25 :24: 1) e uma com clorofórmio/álcool isoarrulico (24: 1). A62VII Jornada de Iniciação Científica do INPA • 07 a 09 de Julho de 1998 • Manaus - AMconcentração das amostras de DNA foram estimada através de comparações com marcadoresmoleculares de pesos conhecidos em eletroforese de géis de agarose a 0.8% com 0.5 ug/rnl de brometo deetídio em seguida fotografado.Uma vez extraído e checada a qualidade, o DNA de cada espécie foi acondicionado em tubosependorf, com água ultra-pura (milli-q), rotulados e mantidos em freezers à -20°C até uso posterior.Fig.Ol- Molécula de DNA com suas bases pareadasForam extraídas amostras de DNA de quarenta e um especimens de peixes da ordemGyrnnotiformes e trinta e sete Ordem de Siluriformes perfazendo um total de setenta e oito amostras deDNA dos quais quinze tiveram o DNA descrito nos resultados preliminares.A tabela 01 abaixo indica os espécimens da ordem Gyrnnotiformes e Siluriforme que foram coletadose dos quais foram extraídos os DNAs com suas respectivas localidades.N° ESPÉCIMENS DA O.GYMNOTIFORMESLocal dacoleta01 Adontosternachus cf. balenops,02i Adontosternachus sp.03 Adontosternachus sp.04 Adontosternarchus balaenops05 Apteronotus albifrons06 Apteronotus bonaparti07 Brachyhypopomus brevirostrisO~' Brachyhypopomus brevirostris091\ B. cf. pinnicaudatus1.0 Brachyhypopomus sp.11 Eigenmannia cf. macrops12 Eigenmannia sp.13 Eigenmannia sp.14 Gymnotus aguilaris15 Gymnotus carapo16' Gymnotus cf. aguilaris17 Rabinolichops cf .esatwardi18 Ranphictis rostratus19 Steatogenys elegans20 Steatogenys sp.21 Sternachella sp.22 Sternachella sp.23:; Sternacogiton sp24 Sternacohynchus mormyrus26 Sternacorynchus cf. mormyrus21 Sternarcohynchus sp.Local da N°Coletachantaria· 01reh 02'ro .'adeí 03Rio Madeira 04Rio Madeira 05I.Marchantaria 06Boa Vista 07Ri()Madei 08iiiJâriâuaeá 09Rio Madei 10Boca - Tarumã . 11Boca - Tarumâ 12I.Marehantaria 13Rio Madeira 14Uruguai 15ad 16go-Jan cá 17.'Lago - Catalão 18Tarumã . 19I. Marehantaria 20Tarurnã 21arehantaria 22reha' a 23areha 24arohàntària ; 25I.Marehantaria 262728. 2930313233. 34ESPÉCIMENS DA O.SILURIFORME63TarurnãTarurnãI. MarchantariaI. MarchantariaI. MarchantariaRio MadeiraTarurnãTarurnãRio MadeiraI. MarchantariaI. MarchantariaI. MarchantariaI. MarchantariaI. MarchantariaLago - CatalãoI. MarchantariaRio MadeiraI. MarehantariaI. MarchantariaI. MarchantariaI. MarchantariaI. MarchantariaI. MarchantariaTarumãI. MarchantariaI. MarchantariaI. MarchantariaI. MarchantariaI. MarchantariaJanauacáTarumãI. MarchantariaTarumãTarumãVII Jornada de Iniciação Científica do INPA • 07 a 09 de Julho de 1998 • Manaus - AMRio MadeiraI. MarchantariaTabela 01 - Espécimens coletados dos quais foram extraídos seus DNAs. No Brasil a maioria pertence aoEstado do Amazonas (Rio Madeira, Lagos do Catalão e Janauacá, Boca do Tarumã, Tarumã, Ilha daMarchantaria).Mecanismo de eletroforese e análise do gel : Numa eletroforese, fez-se o DNA da amostra migrarem um campo elétrico através de uma matriz porosa. Durante o processo de extração de DNA tanto aagitação mecânica das amostras como a atuação de enzimas causam fragmentação do DNA liberadodas células. Nas figuras 02 e 03 pode-se visualizar dois géis de agarose com amostras de DNA noqual pode-se notar que a maioria das amostras apresentam uma banda definida de maior pesomolecular assim como fragmentos de tamanho variado que conferem a algumas faixas das figuras umaspecto difuso. As amostras de DNA foram inoculadas no lado esquerdo e a migração se deu nosentido esquerda para direita.Figura 02 - Gel de agarose no qual foi verificada a qualidade do DNA deespécimens. Os números seguir indicam o espécimen na tabela 01 e a letracorrespondente a ordem ao qual pertence, siluriforme (S) e Gyrnnotiforme (G). Aprimeira coluna mostra o DNA dos espécimens (de cima pl baixo) 4G, 8S, 15G,1S, 7G, 8G, 7S, 19G, 24S, 34G e marcador molecular. A Segunda coluna (de cimapl baixo) contêm os espécimens 23G, IIG, 17S, 33S, 30S, 9G e marcadormolecular. A maioria das amostras possuem DNA de alto peso molecular.Figura 03 - Gel de agarose com as amostras de DNA dos espécimensdas ordens gymnotiformes (G) e siluriformes (S). Os da primeiracoluna (de cima p/ baixo) 18G, 24G, 25G, 19S, 21G, 3G, lOG, 16G,12G, 14G e marcador molecular. Na sugunda coluna têm-se oso DNA foi extraído com sucesso dos representantes das duas ordens estando em boas condições paratrabalhos futuros. Desta forma, foi iniciado um banco de DNA do INPA que futuramente pode sedesenvolver num projeto maior, ligado às coleções e incluir outros tipos de organismos (inclusiveinvertebrados); e finalmente, o material coletado será usado para iniciar um estudo sobre genéticapopulacional com marcadores moleculares em gyrnnotiformes e siluriformes, comparando populações deigarapés (afluentes) de margens opostas dos rios Negro e Solimões. As análises de DNA se mostramimportantes no contexto da pesquisa, principalmente no que concerne a análises de filogenia, populações,clonagem de genes, de biologia molecular, de fluxo gênico e biogeografia.ALVES-GOMES,1. A.; ORTI, G.; HAYGOOD, M.; HEILIGENBERG, W. and MEYER, A. Phylogenetic analysis ofthe south american electric fishes (order Gyrnnotiformes) and the evolution of their electrogenic system: a synthesisbased on morphology, electrophysiology, and mitochondrial sequence data. Molecular Biology AndEvolution (1995),12(2): 298-318.;BEIGUELMAN,B. Citogenética Humana. Ia edição. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S. A., 1982. p12.FINK, S. AND FINK. W. 1981. Interrelationships of the ostariophysan fishes. Zoological Journal of the Linneansociety.(1981),72: 302.LEHNINGER, A. L. Princípios de bioquímica. 2a edição. São Paulo: Editora Sarvier. p242 e p612.MOLLER, P. Electric Fishes History and behavior. I a edição. London, USA: EditoraChapman & Hall. p282 e p440.STRYER, L. Bioquímica. 3a edição. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S. A., 1988.p59-7.64

Montagem de Um Banco de Dna para Peixes das Ordens Gymnotiformes Siluriformes No Inpa

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Montagem de Um Banco de Dna para Peixes das Ordens Gymnotiformes Siluriformes No Inpa

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