Go PROTEİNİNİN ALFA ALTBİRİMİNİN ÜÇÜNCÜL YAPISININ DENEYSEL VE KURAMSAL OLARAK İNCELENMESİ
Bu çalışmada, merkezi sinir sistemi ve beyinde yaygın bulunan Go proteininin a altbiriminin yapısı deneysel ve teorik yöntemlerle incelendi. Goa’nın üçüncül yapısı ve işlevi tam olarak bilinmediğinden, benzeşim modellemisi çalışmalarıyla yapısı ve işlevi aydınlatılmaya çalışıldı.
Ekspresyon deneylerine pGEX-4T2/BL21(DE3)pLysS sisteminde başlandı. IPTG’ye bağlı yüksek ekspresyon düzeyine ulaşılarak Go protein büyük miktarlarda elde edilmesine karşın, protein çözünür olarak elde edilemedi. Proteinin çözünür kılmak için birinci deneysel strateji olarak farklı kültür koşulları denendi. Çözünürlük sorunu aşılamadığından ikinci deneysel stratejisi olarak protein inklüzyon cisimcikleri olarak saflaştırılıp 1 x PBS’e karşı diyaliz edildi. Çözünürlük sorununun devam etmesi üzerine NDSB ajanı, pET-28a ve pQE-80 vektör sistemleri kullanılarak yeni girişimlerde bulunuldu. NDSB ajanı ve pET-28a sistemi ile çözünürlük sorunu aşılamamasına karşın pQE-80 vektör sistemi ile çözünür protein elde edilmiştir.
Teorik çalışmada, yapısı bilinen proteinlerin dizileri kalıp olarak kullanılarak Goa’nın üçüncül yapısı modellendi. Genel G-proteini topolojisi elde edildi. Ancak 115-122. amino asitleri kapsayan bölgedeki halkanın yapısı dizi benzerliğinin yetersizliği nedeniyle son şekline kavuşturulamadı. Modele ilişkin moleküler dinamik çalışmaları sürmektedir.
STUDIES ON THE TERTIARY STRUCTURE OF ALPHA SUBUNIT OF Go PROTEIN BY EXPERIMINTAL AND THEORETICAL METHODS
In this study, the tertiary structure of a-subunit of Go (Goa) which is the most abundant type of G-protein in central nervous system was studied by both experimental and theoretical methods. Because the tertiary structure of Goa is unknown and the function of is not clear yet, in context of the structure-to-function paradigm it was aimed to propose arguments for the function of Goa using homology modelling.
Expression experiments were initiated using pGEX-4T2/BL21(DE3)pLysS system. Due to IPTG dependent overexpression, large amounts of Go protein was obtained but the protein was mostly insoluble. To overcome the solubility problem, different incubation temperatures and IPTG concentrations were tried as the first experimental strategy. This did not result in increase of soluble protein. As the second experimental strategy, the protein was purified as inclusion bodies and then dialysed against 1xPBS buffer. The soluble protein could not be obtained by this method, either. Two other attempts, one using NDSB, a mild solubilizing agent, and the other, cloning to the pET-28 vector system, did not work. Finally, Go protein was purified from cytoplasmic fraction using pQE-80 vector system.
In theoretical studies, the tertiary structure of Goa was modelled by using known structures that have high sequence similarity to our sequence as a template. Overall G-protein topology was obtained except for a loop encompassing residues 115-122. Molecular dynamical and molecular mechanics studies to refine the modelled structure are in progress
