Impact of genetic variability within Long Terminal Repeat region and integrase gene on HIV-2 replication

Abstract

Le VIH-2 est souvent considéré comme un modèle d’infection rétrovirale atténuée, du fait de sa faible réplication virale, des faibles taux de transmission et de la progression plus lente vers le stade SIDA des patients infectés. Les mécanismes causaux de cette moindre physiopathologie sont encore mal connus. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la diversité du VIH-2, notamment dans deux régions génomiques : l’intégrase et la région Long Terminal Repeat (LTR). Nous avons tout d’abord amélioré la technique classique d’isolement de souches virales afin de disposer de davantage de souches de VIH-2, en purifiant les échantillons de patients avec des billes anti-CD44. Ensuite, nous avons utilisé ces souches pour étudier la sensibilité aux inhibiteurs de transfert de brin de l’intégrase, ou INSTI. Au cours de ce travail, nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme de résistance aux INSTI chez le VIH-2, l’insertion de 5 acides aminés après le codon 231 du gène de l’intégrase. Cette insertion est responsable d’une résistance importante au raltegravir (RAL), à l’elvitegravir (EVG), au cabotegravir (CAB), ainsi qu’une résistance modérée au dolutegravir (DTG). La sensibilité au bictegravir (BIC) était conservée pour certains isolats porteurs de cette insertion. Une insertion de deux acides aminés a aussi été observée transitoirement chez un patient. Nous avons confirmé ces observations phénotypiques en construisant des virus porteurs de ces insertions par mutagénèse dirigée. L’insertion, qu’elle soit de 2 ou de 5 acides aminés, n’était pas responsable d’une perte de capacité réplicative, à l’exception du mutant avec l’insertion GIRGK.En revanche, la structure prédite de l’intégrase est fortement modifiée, avec notamment la perte d’un des deux feuillets bêta composant le tonneau bêta du domaine C-terminal.La sensibilité phénotypique des mutants a été déterminée, pour les insertions de 5 acides aminés, les résultats étaient similaires à ceux obtenus avec les isolats cliniques. Nous avons aussi pu déterminer la sensibilité du mutant avec l’insertion GK, qui était sensible au BIC et au DTG, mais déjà pleinement résistant à RAL et au CAB. Dans la dernière partie de notre travail, nous avons étudié la variabilité dans la région LTR des provirus de 66 patients naïfs d’antirétroviraux, inclus dans la cohorte ANRS CO5 VIH-2. La variabilité génétique était plus importante dans les séquences du groupe B, du fait notamment de nombreuses insertions et délétions dans la sous-région «régulatrice» comprenant l’ensemble des sites de fixation de facteurs de transcription cellulaire. Ces virus du groupe B présentaient une délétion de quelques nucléotides dans la région contenant les sites de fixation PuB1 et pets, causant une perte de ce dernier site de fixation. De plus, 4 provirus du groupe B présentaient une délétion du premier site de fixation du facteur de transcription ubiquitaire Sp1. Cette variabilité entraînait des conséquences sur l’activité transcriptionnelle de ces LTR. Les LTR du groupe A et du groupe B présentaient la même activité transcriptionnelle basale mais, dans les cellules Jurkat, après activation cellulaire, l’activité transcriptionnelle des LTR du groupe B et d’un LTR de groupe A dans lequel la zone contenant la délétion de pets a été insérée était 10 fois plus faible que celle du LTR de groupe A. La délétion du premier site de fixation de Sp1 diminuait l’activité transcriptionnelle basale dans les cellules Jurkat et la réponse à la transactivation par la protéine virale Tat dans les cellules HEK293T.HIV-2 is oftenconsidered as an attenuated model of HIV-1 infection. Indeed, HIV-2 is characterized by its lower viral replication, reduced transmission rates and a slower progression towards AIDS of infected-patients. Mechanisms implied in HIV-2 reduced pathogenicity are not entirely understood. In our work, we have focused on HIV-2 diversity, especially in two genomic regions: the integrase and the Long Terminal Repeat (LTR) region.We have improved the culture method, by purifying clinical samples using anti-CD44 paramagnetic beads. This allowed us to increase the number of viral strains in our collection. Then, we used those strains to study phenotypic susceptibility to integrase strand transfer inhibitors (INSTI). During this study, we identified a new molecular mechanism of resistance to INSTI, a 5 amino-acids insertion after codon 231 of HIV-2 integrase. This insertion was responsible for a high level of resistance to raltegravir (RAL), elvitegravir (EVG), cabotegravir (CAB), and a slight increase in the resistance todolutegravir (DTG). Certain isolates harboring this insertion remained susceptible to bictegravir (BIC).A 2 amino-acids insertion was also transiently observed in one patient. We have confirmed those phenotypic data by constructing HIV-2 mutants by site-directed mutagenesis. Whether the insertion was composed of 2 or 5 amino-acids, replicative capacitywas similar to the wild-type virus, except for the mutant with a GIRGK insertion. However, the predicted structure of mutated HIV-2 integrases was modified, notably in the C-terminal domain, due to the loss of one of the two beta sheets composing the beta barrel. Phenotypic susceptibility of mutants was determined and results for HIV-2 mutants witha 5 amino-acids insertion were similar to those obtained with clinical isolates.We also determined the susceptibility of the mutant with a GK insertion. It was susceptible to BIC and DTG, but already resistant to RAL and CAB. In the last part of our work, we have characterized genetic variability within LTR region in 66 antiretroviral-naïve patients, included in the French ANRS CO5 HIV-2 cohort.Genetic variability was higher among group B sequences, due to a high number of insertions and deletions in the «regulatory» sub-region that encompasses all transcription factor binding sites. All group B viruses presented a short deletion in the region encompassing PuB1 andpets binding sites, causing the loss of the pets binding site.Furthermore, 4 group B viruses had also a deletion of the first binding site of Sp1 transcription factor. This variability impacted LTR transcriptional activity. Group A and B LTRs presented asimilar basal transcriptional activity but, in Jurkat cells, after cellular activation, transcriptional activities of group B LTR and a group A LTR in which the deletion of pets binding site has been introduced were 10-fold lower than the transcriptional activity of an intact group A LTR. The deletion of the first Sp1 binding site reduced the basal transcriptional activity in Jurkat cells and the response to transactivation by the viral protein Tat in HEK293T