Selection and assembly of bioprotective agents for the control of Salmonella enterica serovars found in Normandy in the PDO raw milk cheese industry : application to Camembert of Normandy

Abstract

Dans le domaine du secteur laitier, le lait cru peut être soumis à de nombreuses sources de potentielle contamination par Salmonella. Si l’utilisation de traitements thermiques ou de conservateurs chimiques permet d’éliminer les pathogènes potentiellement présents, certaines filières fromagères ne peuvent pas appliquer ces solutions. C’est le cas des fromages normands AOP fabriqués au lait cru. L’utilisation de la biopréservation représente à l’heure actuelle un moyen efficace de lutte contre Salmonella dans cette filière. Cette étude a eu pour objectifs de : développer une méthodologie globale permettant un criblage à haut débit, par une ou plusieurs méthodes, d’agents microbiens potentiellement inhibiteurs le tout dans des matrices et conditions proches de la matrice laitière, construire des associations « intelligentes » d’agents inhibiteurs sur la base de la complémentarité de leurs modes d’action, les valider en modèles in vitro et expérimenter les associations sélectionnées en transformation fromagère afin de suivre leur implantation et interactions avec le processus de fabrication. Dans un premier temps une méthode de criblage haut-débit miniaturisée permettant un criblage d’isolats producteurs de composés dans des conditions proches de la matrice laitière a été mise au point et validée. Une seconde méthodologie de criblage ciblant les interactions nutritionnelles a ensuite été mise au point à l’aide de souches de Salmonella transformées dont la luminescence caractérise l’activité métabolique, le tout dans deux milieux liquides chimiquement définis mimant la matrice laitière. A partir de la méthode 1, 1 450 isolats issus de l’environnement laitier ont été criblés sur trois milieux (BHI, lait et fromage), permettant de sélectionner 30 isolats actifs, principalement des genres Lactococcus et Aerococcus. Deux fois plus d’isolats ont été actifs en milieu lait et fromage par rapport au milieu BHI. La majorité des isolats ont montré une production d’acide lactique et acétique, mais également de peroxyde d’hydrogène pour le genre Aerococcus. La seconde méthode mettant en évidence des interactions en milieu liquide a permis de sélectionner 47 isolats actifs dans au moins un milieu modifié. Après étude des prérequis pour l’utilisation en industrie alimentaire, 15 isolats ont été retenus pour effectuer des associations binaires puis ternaires. La potentialisation des activités de 5 isolats en associations ternaires, ayant différents mécanismes d’actions, a permis de sélectionner trois associations qui ont, par la suite, été évaluées pour leur activité anti-Salmonella en matrice laitière ainsi qu’en essais pilotes.In the dairy sector, raw milk can be subjected to many potential sources of Salmonella contamination. While the use of heat treatments or chemical preservatives makes it possible to eliminate the pathogens potentially present, certain cheese sectors cannot apply these solutions. This is the case with PDO Normandy cheeses made from raw milk. The use of biopreservation currently represents an effective way of controlling Salmonella in this sector. The objectives of this study were to: develop a global methodology allowing high throughput screening, by one or more methods, to detect inhibitory microbial agents, all in matrices and conditions close to the dairy matrix, to build "smart" associations of inhibiting agents based on the complementarity of their modes of action, validating them in in vitro models and experimenting with the selected associations in cheese processing in order to monitor their implantation and interactions with the manufacturing process. First, a miniaturized high-throughput screening method allowing screening of isolates producing compounds under conditions close to the matrix was developed and validated. A second screening method targeting nutritional interactions was then developed using transformed Salmonella strains whose luminescence characterizes metabolic activity, all in two chemically defined liquid media mimicking the dairy matrix (milk and cheese). From method 1, 1,450 isolates from dairy environment were screened on three media (BHI, milk and cheese), allowing the selection of 30 active isolates, mainly from the genera Lactococcus and Aerococcus. Twice more isolates were active in milk and cheese medium compared to BHI medium. The majority of isolates showed production of lactic acid and acetic acid, but also hydrogen peroxide for the genus Aerococcus. The second method, demonstrating interactions in a liquid medium, allowed to select 47 isolates active in at least one modified medium. After studying the prerequisites for use in the food industry, 15 isolates were selected to perform binary and then ternary associations. The potentiation of the activities of 5 isolates in ternary associations, having different mechanisms of action, made it possible to select three associations which were subsequently evaluated for their anti-Salmonella activity in dairy matrix as well as in pilot tests