Satoru Watanabe

Shoichi Sato

Sumika Nagase

Taiichi Saito

佐藤 彰一

斎藤 泰一

永瀬 澄香

渡辺 悟

永瀬, 澄香

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佐藤, 彰一

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渡辺, 悟

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斎藤, 泰一

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Kawasaki College of Allied Health Professions Institutional Repository / 川崎医療短期大学学術機関リポジトリ

陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー―OPA蛍光法によるポリアミン定量一―川崎医療短期大学臨床検査科 川崎医科大学薬理学教室＊永 瀬 澄 香 佐 藤 彰 一 ＊渡辺 悟 ＊斎藤泰一（平成 3年 8月26日）Determination of Polyamines Using Cation-exchange High-Performance Liquid Chromatography with o-phthalaldehyde Fluorescence Detection Sumika NA  GASE, Shoichi SA TO, Satoru WATANABE* and Taiichi SAITO* Dゅartmentof Medical Technology, Kawasaki College of Allied Health Professions • Department of Pharmacology, Kawasaki Medical School Kurashiki, Okayama 701-01, Japan (Received on Aug. 26, 1991) Key words : HPLC, ボリ ミアン，Putrescine,Cadaverine, Spermidine, Spermine 概要13 ポリミアン定罷は，悪性腫瘍の診断，転移の有無，予後の治癒およぴ治療効果の判定に有用であることが知られている。そこで我々は組織中ボリアミンの動態に箔目し，定屈を試みた。以前逆相 HPLC-Benzoyl誘森体法の問題点を減少させるための改良を行った。しかし，この方法は前処理が煩雑であるのみならず，感度およぴ粕度にも問題があったので，今回1湯イオン交換樹脂を用いた HPLC-OPA蛍光法の検討を行った。ボリアミンの各成分 (Putrescine,Cadaverine, Spermidine, Spermine)は，単一移動相で陽イオン交換樹脂カラムにより分離後，0-フタルアルデヒド (OPA)誘迎体に変えて検出するボストカラム蛍光検出法で定磁した。分析時間は移動相のpHおよび流出容蜀等を検討した結果，約45分に短縮でき，各ピーク間の分離能も良好であった。測定感度は従来行ってきた Benzoyl誘森体法に比べ約20倍に向上し た。また，各ボリアミンの最小検出批は 1~ 5 pmolであった。標準液の直線性と同時再現性，日差再現性およぴ 2回繰り返し再現性の結果はすべて良好であった。これらの結果はラット組織中のボリアミンの連続多検体測定が簡単に感度良〈行えることを明らかにした。はじめにボ リアミンは1678年 Leeuwenhoerが人の精液中に，Spermineのり ん酸塩の結晶として顕微鏡下で発見したのが最初である。ポリアミンとは，第一級アミノ基を 2つ以上もつ直鎖の脂肪族炭化水素の総称であり，代表的なものに Putres-cine (PUT), Cadaverine (CAD), Spermidine (SPD), Spermine (SPM)などがある。これらのボリアミンは細胞分裂 ・核酸生合成 ・蛋白生合成に重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。一方，1971年 RuseJ1l2)が各種癌患者において，尿中ボリアミン排泄撮と癌増殖との関連性を報告して以来，悪性腫瘍の有効な診断方法として注目されてきた3)4)。その後尿中ポリアミ ンの増加は必ずしも癌に特異的でな14 永測澄香•佐藤彰ー・渡辺 悟 ・斎藤泰一いことがわかり ，腫瘍マーカーとしての意義は少なくなっている。しかし， P.S. Sunkaraらは1982年にルイス肺癌を移殖したマウスにボリアミン生合成阻害剤を投与したところ，腫瘍の増殖抑制とともに肺への転移を強く抑制することを発見した叱 この転移の抑制はボリアミンの添加により完全に消失したために，癌の転移機構にもボリアミンが必須の働きをしていることが判明した。つまり，特定の臓器に作用するボリアミン生合成阻害剤は特定臓器に発生した癌の増殖と転移を抑制すると考えられる。斎籐ら はフェルラ酸がラット前立腺のポリアミン合成を特異的に抑制したと報告している叫これらの臓器中のボリアミンを定量するには濾紙電気泳動，薄層クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィー等が初期の段階で用いられたが，いずれも感度が低く， 複雑な前処理を必要とした。以来多くの改良が重ねられ，最近では高速液体クロマトグラフィー (HPLC)が広く用いられるようになった。我々は Verkoelenら”の逆相 HPLCによるポリアミンの Benzoyl誘焉体法を改良 した8)0この改良点はポリアミンの誘蔚体合成の際に生成し， HPLC測定に障害となる生成物を防ぐことであった。しかし，いまだにこの逆相法は移動相と検出方法に多くの問題を有している。そこで前処理時間の短縮と測定精度を上げる目的で，陽イオン交換樹脂を用いた HPLC-OPA蛍光測定法9)を検討し たので報告する。装置および試薬1.分析装置装置は，システムコントローラ802-SC, オートサンプラ851-AS,送液ポ ンプ880-PU,カラムオーブン860-CO,蛍光検出器821-FP,およびインテグレータ850-GIから構成した日本分光高速液体クロマトグラフを使用した。本実験に用いた流路構成を Fig.1に示した。カラムは陽イオン交換樹脂である日本分光社製の POLYAMINEPAK (0. 6cm ID x 3. 5cmL, 充埴剤ースルホン化スチレン ・ジピニルベンゼン共重合体）を用い，温度は分析中70℃に保っが‘-O 2.試薬Putrescine, Cadaverine, Spermidine, 1, 6 -Diaminohexane, Spermineは Sigma(St. Louis. MO USA)製のものを用いた。 クエン酸ニナトリウムニ水和物はアミノ酸分析用（半井テスク K.K), OPAは蛍光分析用 （半井テスHP LC (Japan Spectroscopic Co., Ltd, Tokyo, Japan) Buff er pump Column Oven (860-CO) 99999 r e ーI mo er tt sn yo sc 9999ヽ9999,＇integrator (850-G I) (880-PU2) :・----1---・-----・・---・ ・-・-----Mobile phase I H I OP A reagent (802-SC)Fig. 1 Flow diagram of cation-exchange HPLC. 陽イオン交換 HPLC-OPA 蛍光法によるポリアミン定量 15 クK.K)，他は和光純薬 K.Kの特級 （生化学用）を用いた。実 験移動相と OPA試薬の調製は次に示すとおりである。移動相 (Buffer): 3.0 M クエン酸ニナトリウムニ水和物， 凡 0を加えて 1£にし，60％過塩素酸でpHを調製した。反応相 (OPA反応液）：ほう酸24.7 g,水酸化カリウム23.0 g, H,O 980me, 10% Brig 35水溶液6.0me,16% OPAエタノール溶液lOme,最後に 2-メルカプトエタノール2.0面を加えて調製した。なお，移動相および反応液はミリポアフィルター (poresize O. 45 μm)で濾過後，20分間脱気したものを HPLCに用いた。ラット組織中ボリアミン定量に用いた試料の調製方法は Table.1に示した。最終的に得られた水溶液は移動相で2倍希釈し， ミリボアフィルターで濾過後，この溶液10直をHPLCに注入した。結果および考察従来用いられた Benzoyl誘導体法はポリアミンを Benzoyl 化するため，水溶液相に 2N-NaOH, benzoyl chlorideを加え，一夜 （約12時間）60℃で加温を要する。生成した benzoylpolyamineはエーテル抽出をする。抽出 後 エーテルを dry応で除去し，残i査をメタノールに溶解して HPLCに10μ1注入する。この方法はTable 1 Extract procedure of various tissues and organs of rats. OPA蛍光法に比べて前処理が煩雑で非常に時間を要するため，迅速で高い精度のポ リアミン定量には不向きである。また，従来の HPLC(OPA)法による方法はイオン交換モード，逆相分配モードであ っても2種または 3種の移動相を用いるグラジェント溶離法を使用していた。これは Putrescine, Cadaverine, Spermidine, Spermineの分離を単一移動相で行うと Spermineが強く保持されてしまうため，同時分析が難しくなることか ら行われてきたものである。しかし，グラジェント溶離法を用いる場合は一回分離後，分析系を初期の移動相まで完全に置換し，平衡になるまで待たねばな らないなどの時問すなわちエージングが必要となる。また，移動相の置換が行なわれるため，試料禅入のタイミングが一定しないことから，保持時間かずれてしまい定墨精度を悪くするなどの問題があvarious organs of the rats ←homogenization (10% TCA 2 me) ←centrifugation 2500 rpm 15 mm ←supernatants are washed by diethylether 比0layer I ←filtration by o.45 μm miliporefilter 10成 ofthe filtrate is charged to the HPLC system った。今回，我々が行った HPLC-OPA蛍光法によるポリアミン定最は単一組成の移動相で各成分を良好に分離する方法，結晶析出を回避する法としてプランジ ャー洗浄装置をボンプに取付けること ，pHを調整する方法などの測定条件の検討と併せて精度 ・再現性試験を行った。1)ポリアミンの検出ボリアミンは紫外部，可視部領域に吸収がな〈，自然蛍光もない。従って HPLCでの検出は，紫外部測定の場合ダビシル化， ダンシル化， トシル化などの誘導体， また，蛍光測定の場合はフロレッサミン，OPA などの誘導体が利用される。我々は誘導体反応が容易で比較的簡単な自動化システム （日本分光）で利用できる OPA法を用いた。検出最適波長を知るため，ポリアミン標準液と反応試薬を混和し，蛍光スペクトルを見た。その結果，検出波長は励起波長340nm,蛍光波長450nmが最適であることがわかった。組織中のボ リアミンはカラム分離後，OPA-メルカプトエタノール反応試薬と反応させ，生ずる発蛍光体の蛍光量を検出し， クロマ トグラムの面租をインテグレータによ り計算し定量した。2)移動相のpH変化および流量の検討① pHの検討移動相におけるpHを5.2-6.2まで変化させた16 永測澄香 • 佐藤彰ー ・ 渡辺 悟・斎藤泰一ときの保持時間を比較検討したと ころ，移動相pHが高 くなるほど保持時間が延長した (Fig.2)。しかし，pH5.0以下では移動相中に結晶を生じ測定が不可能となった。以上のことから移動相の分析に至適なpHは5.2~5.4であるこ とが確認できた。② 移動相流量の検討移動相のpHを5.2とし，移動相流量を変化させたときの保持時間を検討した (Fig.3)。流量を0. 85me/minより大きくするとポンプに負荷がかかり， I.Orne/min以上にする ことは機械的に不可能であったか，流量が大きくなればなるほどポリアミンは小さい保持時間で流出した。各ポリアミンのピークは流量が0.65-0.85me/minの間で重ならず，分析精度にも影咽しなかった。しか し， 0.85me/minの場合，移動相と OPA反応液との混液に混濁を生じた。以上のことから移動相流量は0.some/minが適当であると考えられた。①および②の検討結果は移動相pH5.2, 流鼠o.some/minの分析条件が至適であることを示した。本条件下の HPLCでは Putrescineが 6分，Spermidineが16分，1,6-Diaminohexaneが30分，Spermineか約41分で流出し，一回約45分で分析が可能となった (Fig.4)。3)直線性各ポリアミン浪度250pmol/ μR標準液は10,20, 30, 50, 100, 200, 250 pmol／成に段階希釈を行い直線性を調べた。ベースラインの乱れが生じない程度までインテグレータの感度を上げ，蛍(min) Spermine 60 1,6-Diaminohexane (1) E 40 •一I-Spermidine ゜2 UO!IUataH Put re seine 0 "5•0 5.5 Buffer pH 6•O Fig. 2 A relation between the retention time of polyamine and pH of mobile phase buffer. (min) 60 ゜4 OEに゜2 uonua1a1:1 Spermidine Putrescine 0 0.65 0.75 Flow - Volume O,BS(ml/min) Fig. 3 A relation between the retention time of polyamine and flow-volume (mQ/min) of mobile phase buffer. 陽イオン交換 HPLC-OPA蛍光法によるボリアミン定量 17 Table 3 Simultaneous reproducibilities of a stan-dard mixture and sample of the thymus calculated from peak area, and of separ-ative time for putrescine (PUT), spermidine (SPD), 1, 6-diaminohexane (DAH) and sper-mine (SPM). Polyarn1ne PUT SPD DAH SPM Standard x 2 601 2 648 2 603 2 678 (nmol/10成） SD 0 0259 0 0326 0 0352 0 0597 [n = 6) CV% l 00 I 29 I 350 2 29 Rat Thymus X 0 204 2 684 0 856 (nmol/10成） SD 0 0103 0 1338 0 0428 [n = IO] CV% 5 082 4 987 5 01 Separative X 6 80 16 80 43 93 time (min} SD 0 0100 0 0196 0 0351 [n = 20] CV% 0 417 0 17 0 080 Table 3 Reproducibility of duplicate determination of sixty samples from various tissues of rats. n = 60 PUT SPD SPM Tatal PA X 0 0643 1 3260 0 8430 2 2333 SDX 0 0750 1 9124 1 1032 3. 0611 Y 0 0657 1 3160 0.8191 2 2007 SDY 0 0780 l 8968 1 0441 2 9934 r 0 9830 0 9995 0 9977 0 9994 IA 1 023 0 991 0 944 0 977 Y = AX x B 1B -0 0001 0.0014 0 0230 0 0180 Polyamine contents (nmol/mg) 光強度を拡大し検量線を作成した (Fig.5)。その結果， Putrescine,Cadaverine, Spermidine, 1, 6-Diaminohexane, Spermineの 5成分すべてが原点を通る良好な直線性を示した。最小検出濃度は Putrescineが 1 pmol／成， Spermidineが 3pmol／叫 Spermineか 5 pmol／咸程度と高感度であった。分析に必要な標準液の最小量は Benzoyl誘導体法”で約50nmolであったが，今回の OPA法は約2.5nmolと約20倍感度か高いことが判明した。4)同時再現性および 日差再現性① 同時再現性同時再現性を オー トサンプラを用いて調べた結果， 2.5nmol/10成を標準液 (n= 6)はCV :0.99%-2.23％となり ，ラット胸線検体(n= 10) はCV:4.99% -5.08％であり ，測定精度は良好なことがわかった。I a a ＇ I ， ＇ ｝ ｀ i＞、i i  ＂ I I ゜＇ 疇一‘c: a ・…..Putrescine ． b…….Spermidine C• …•• • 1,6 -Diaminohexane d….. Spermine b ゜20 Elution Time Fig. 4 Comparison between the present (---) and previous (-) analysis for determination of polyamines using cation-exchange HPLC with o-phthalaldehyde fluorecence detec-tion. (x106) 10 卜 •···1,6 -Diaminohexane □・・・Cadaverine at- • · · · Spermidin e △--Putrescine 悶 6ト・・・Spermine ~ ＜ c 40 60(min) 4 工ead2 ゜100 200 (pmol/pl) Concentration Fig. 5 Calibration curves for determination of polyamines. 次に分離時間の同時再現性を調べた結果，2.5nmol/10凪 標 準 液 (n= 20) は CV:0.08%  -0.15% となり再現性が良いことがわかった(Table. 2)。② 日差再現性日差再現性 (n= 6) は Putrescineで CV :6. 02%, Cadaverine で CV :4.31%, Sper-midineで5.19%, 1, 6-Diaminohexaneで5.10%, Spermineで6.92% となった。5) 2回繰り返し測定の再現性ラッ ト Control群 （体重180g前後の 7週齢18 永測澄香 ・佐藤彰ー・渡辺 悟・斎藤泰一▲SD系雄ラットを使用）6匹について，各組織中ボリアミン (n= 60)における 2回繰り返し測定の再現性は，満足すべき結果を示した(Table3)。6) ラット組織中のポリアミン分析ラッ ト組織試料禅入はオートサンプラを用い昼夜間連続測定しても問題を呈 しなかった。一昼夜で約30検体連続測定か可能であ った。ボンプベソド自動洗浄装置 （日本分光 k.k)を導入することにより，結晶析出を回避することができ，保守面での問題が解決され連続多検体測定か十分可能となった。結 論賜イオン交換樹脂 HPLC-OPA蛍光法を用いてポリアミン定量の検討を行った結果，検出感度は従来の Benzoyl誘禅体法に比べて20倍高く，一回の分析時間は単一組成の移動相で約45分に短縮することができた。ま た，検爵線の直線性および再現性は良好であり， ラット組織中のポリアミン分析に応用できる結果を得た。これらの検討結果より，今回行った HPLC-OPA蛍光法は迅速で高感度なポリ アミン分析法であり，制癌剤などの薬物療法の有効性をみるモニターとして今後応用するのに十分有用であると 考えられる。現在我々は， 5-Fu,AraCの 2種類の制癌剤およびフェルラ酸誘消体をラ ットに投与し，これらの薬剤がどのようにボリア ミン代謝に影響を及ぼすか検討している。謝 辞稿を終えるに当たり，本研究にご協力いただいた臨床検査科第16期生，米田有希，吉田清子，黒木あい子，山中牲子および福田寿美の各君に深く感謝いたします。文献1) Russell, D. H. : Increased polyamme concen-trations in the urine of human cancer patients Nature New Biol., 233, 144-145, (1971) 2) Russell, D. H., et al. : Urinary polyamines m cancer patients. Cancer Res., 31, 1555-1558, (1971) 3) Abdel-Monem, M. M. and Ohno, k. Polyamine metabolism I : Urinary acetyl polyamines in human cancer. J. Pharm. Sci., 67, 1671-1673, (1978) 4)久保田俊一郎，他：腫瘍マーカーとしての尿中ポリアミンの新しい簡便 ・迅速測定法．医学のあゆみ， 124, 22-24, (1983) 5) Sunkara, P. S. et al : An essential role for polyamine in tumor metastases. FEES Lett, 150, 397-399, (1982) 6) T. Saito, et al : Trans-4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid (ferulic acid) inhibits the effect of androgens on the rat prostate. Experientia, 35, 696, (1979) 7) Verkoelen C., et al : Quantitation of polyamines in cultured cells and tissue homogenates by reversed-phase high perfor-mance liquid chromatography of their benzoyl derivatives. J. Chromatography, 462, 41-54, (1988) 8) S. Watanabe, S. Sato, T. Saito, S. Nagase, M. Tomita, S. Ueda and : Investigation of interfering products in the high-performance liquid chromatographic determination of polyamines as benzoyl derivatives. J Chromatography, 518, 264-267, (1990) 9) C. Loser, et al : Reversed-phase liquid chromatographic separation and simultaneous fluorimetric detection of polyamines and their rnonoacetyl derivatives in human and animal urine, serum and tisue samples : an improved rapid and sensitive method for routine applica-tion. J. Chromatography, 430, 249-262, (1988) 

陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー : OPA蛍光法によるポリアミン定量

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