Maranhão, Paulo Abraão Cavalcante

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Repositório do INPA

I Congresso de Iniciação Científica PIBIC/CNPq - PAIC/FAPEAM Manaus – 2012PURIFICAÇÃO DE LECTINA(S) EM SEMENTES DE Swartzia laevicarpaPaulo Abraão Cavalcante MARANHÃO1; José Francisco de Carvalho GONÇALVES2; Andreia VarmesFERNANDES31 Bolsista PIBIC/CNPq; 2 Orientador INPA/CDAM; 3 Co-orientadora INPA/CDAM1.IntroduçãoA bioprospecção de plantas silvestres da Amazônia em busca de medicamentos, moléculas de interesseagrícola e outros bioprodutos florestais não madeiráveis pode ajudar a resolver alguns dos desafiosprementes da humanidade, dentre eles destaca-se a descoberta de moléculas que inibam o crescimentode fitopatógenos (Fernandes et al., 2011). Nesse sentido, a família botânica Fabaceae (Leguminoseae)representa uma potencial fonte de pesquisa, por possuir uma elevada concentração de moléculas N –derivadas, na qual se encontram as proteínas, que podem exercer processos de defesa contra fungos,vírus e bactérias (Pinto et al., 2005). Diversos estudos científicos tem relacionado essa atividadebiológica pelas plantas a um grupo especial de proteínas, denominadas lectinas. Elas são ubíquas atodos os seres vivos, porém são mais comumente encontradas em sementes de leguminosas,correspondendo de 2 a 10% do conteúdo total de proteínas solúveis (Sharon, 1990; Rüdiger e Gabius,2001). As lectinas das leguminosas constituem uma classe de proteínas capazes de aglutinar diferentestipos de células, quando se ligam aos carboidratos que constituem o glicocálix da membrana celular deanimais, de acordo com o grau de afinidade que apresentam. O único pré - requisito para uma proteínaou uma glicoproteína ser classificada como lectina, é que ela possua pelo menos um domínio nãocatalítico, que se liga reversivelmente a mono ou polissacarídeos específicos. (De Hoff et al., 2009;Freitas et al., 2011). Uma das potenciais aplicações biotecnológicas para as lectinas é sua ação comomolécula natural contra fungos fitopatogênicos, como pode ser visto em diversos estudos, por exemplo, orelato de Melo et al. (2005); a lectina (LAA) das sementes de Luetzelburgia auriculata, ligante aD-galactose, conseguiu inibir o crescimento micelial de Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium solani eAspergillus niger, ao adicioná-la no meio de cultura. Considerando essas informações, esse projeto depesquisa teve como objetivo purificar e caracterizar a(s) lectina(s) de sementes de Swartzia laevicarpa,popularmente conhecida como Saboarana, a fim de se obter uma molécula com potencial biotecnológicocontra fungos fitopatogênicos, agregando valor à flora amazônica. E ainda, por meio dos resultadosobtidos, contribuir para o entendimento das relações evolutivas de lectinas, de espécies leguminosaspertencentes à tribo Swartzieae, uma das tribos mais antigas da família Fabaceae.2.Material e MétodosAs sementes inteiras e maduras, obtidas da Estação Experimental de Fruticultura Tropical (INPA) foramtrituradas em moinho analítico de facas até obtenção de um material finamente pulverizado e,homogeneizado em solução salina de NaCl 0,15 M. A suspensão 10% p/v foi mantida sob leve agitaçãodurante 2 horas e centrifugada a 11.000 x g durante 20 minutos a 10 °C. O sobrenadante foi dialisadocontra água destilada durante 48 horas e, liofilizado. Então, com o extrato protéico em mãos, realizamoso ensaio de atividade hemaglutinante (AHE), que consiste na pipetagem em placa de microtitulação dealíquotas de 25 µL de NaCl 0,15 M, da amostra (5 mg/mL) e de eritrócitos 2 % v/v de diferentes animais(rato e coelho). Para a purificação das lectinas foram utilizadas duas resinas cromatográficas distintas, aprimeira foi a de DEAE – Sepharose, na qual as moléculas são separadas por cargas elétricas, e sendoeluídas em gradiente salino de NaCl. A segunda foi a resina de α - Lactose - Agarose, selecionando asmoléculas com afinidade a α – lactose, eluíndo – as com glicina. Para a avaliação da estabilidadetérmica, amostras de proteínas purificadas (1 mg) foram dissolvidas em 1 mL de solução salina (NaCl0,15 M) e aquecidas durante 60 minutos, a 35 °C, 50 °C, 65 °C, 80 °C, 95 °C e 99 °C durante 1 hora.Alíquotas de 25 μL de cada tratamento acima ficaram em repouso a temperatura ambiente por uma horae a AHE das proteínas foi analisada. O perfil protéico do extrato e das frações cromatográficas foi obtidopela eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS – PAGE). Para a visualização de glicoproteínas, os géisforam corados com o Reagente de Schiff (Sigma), apresentando, desta forma, uma cor púrpura para asbandas formadas por glicoproteínas. A determinação da massa molecular e a sequência N – terminal daproteína purificada foi realizada por meio de espectrometria de massas por MALDI-TOF noespectrômetro Voyager DE PRO da PerSeptive Biosystems. Os espectros de massas dos peptídeosobtidos por MALDI-TOF foram analisados e a identificação dos peptídeos por peptide mass fingerprintingfoi realizada utilizando o programa MS – FIT (httpa://prospector.ucsf.edu/ucsfhtm13.2/msfit. htm) e osbancos de dados mais recentemente atualizados do NCBI e Swiss – PROT.3.Resultados e DiscussãoInicialmente, o extrato protéico das sementes de Swartzia laevicarpa apresentou hemólise para o sanguede todos os animais testados, dificultando assim a visualização da presença ou ausência de lectina(s) naamostra, uma vez que para ocorrer a hemaglutinação é necessária a integridade dos eritrócitos. Por meiode pesquisas literárias, conseguimos inferir que esse efeito hemolítico poderia ser devido a um grupo deI Congresso de Iniciação Científica PIBIC/CNPq - PAIC/FAPEAM Manaus – 2012biomoléculas em especial, as saponinas (Marqui et al., 2008). A fim de se fracionar o extrato protéicoobtido a partir das sementes de Swartzia laevicarpa, a amostra foi aplicada em uma coluna de trocaaniônica em resina de DEAE – Sepharose Fast Flow. Nessa cromatografia, obteve-se três picos deabsorbância, que foram dialisados, liofilizados e testados quanto à presença da AHE. As frações quecorrespondem ao PII foram as únicas que apresentaram AHE com eritrócitos de coelho 2 % v/v. Destaforma, realizou - se o ensaio de inibição da AHE, por meio do qual descobrimos que as lectinas dassementes de S. laevicarpa possuem afinidade por D - galactose e α – lactose. A partir desses resultadosselecionamos uma coluna de afinidade para tentar isolar a provável lectina(s). E com base no ensaio deinibição da AHE, aplicamos 80 mL do extrato protéico de Swartzia laevicarpa 2,5 mg/mL numa colunacontendo a resina α – Lactose – Agarose.Figura 1: Cromatografia de afinidade α- Lactose- Agarose do extrato protéico de Swartzia laevicarpa.O perfil protéico do extrato e das frações que correspondem ao PLII, provenientes da cromatografia deafinidade α – Lactose - Agarose foi obtido por SDS-PAGE 12,5% p/v em condições desnaturantes.Indicando provável purificação de lectina(s), visto a presença de uma banda protéica de,aproximadamente, 30 kDa, a qual corresponde à massa molecular característica desse grupo de lectinasde Leguminosas. Para avaliar se a(s) lectina(s) purificada(s) é composta de subunidades, as fraçõescorrespondentes ao PLII foram aplicadas em SDS – PAGE sob duas condições distintas: em condiçõesredutoras (na presença de ß-mercaptoetanol) e em condições não-redutoras (na ausência deß-mercaptoetanol). Por meio da comparação do número de bandas contidas no SDS - PAGE, pode - seinferir que a provável lectina de sementes de S. laevicarpa possui uma única cadeia, uma vez que asfrações com ß-mercaptoetanol, apresentou apenas uma única banda protéica de 30 kDa. Outra forma decaracterização para as lectinas consiste em determinar a presença de um carboidrato ligadocovalentemente a sua estrutura, a fim de classificá – las como glicoproteínas. Para tanto, aplicamos umaalíquota do PLII em um SDS-PAGE e posteriormente, fez – se a coloração com reagente de Schiff. Apartir destes testes, constatamos que a provável lectina de Swartzia laevicarpa é uma glicoproteína pelacomparação com os resultados de outras duas proteínas, a Concanavalina A, uma lectina nãoglicosilada, e a Ribonuclease B, uma clássica glicoproteína.Para se verificar a estabilidade da proteína frente a variações de temperatura, a lectina de Swartzialaevicarpa foi submetida a diferentes temperaturas e em seguida, observada a AHE. Houve diminuiçãodo título hemaglutinante aos 95°C de 28 para 27 e aos 99°C de 27 para 21. Deste modo, podemos inferirque a lectina de Swartzia laevicarpa é termoestável. Porém, a estabilidade térmica a altas temperaturasnão parece ser comum as lectinas de gêneros próximos ao da Swartziae, como observado no trabalho deOliveira et al. (2002), o qual conseguiu purificar uma lectina com afinidade a D-galactose de sementes deLuetzelburgia auriculata e ocorreu perda de função protéica depois de 5 minutos a 80 °C.Por meio da análise dos dados de purificação cromatográfica e caracterização, obtidos até o momento,procedeu-se a análise de espectrometria de massa, a fim de se determinar a massa molecular da lectina.O espectro de massas das frações referentes ao PLII da cromatografia de afinidade α – Lactose –Agarose indicou, por análise no banco de dados do equipamento, que as sementes de Swartzialaevicarpa possui uma lectina com massa molecular igual a 29,009 kDa.I Congresso de Iniciação Científica PIBIC/CNPq - PAIC/FAPEAM Manaus – 2012Figura 2: Espectro de massas TOF – MS da lectina de Swartzia laevicarpa (Matrix – assisted laser –desorption ionization).A proteína purificada foi submetida ao sequenciamento automático de aminoácidos, a fim de se obter asua região N – terminal e concluir sobre a sua identidade (Tabela 1).A sequência N – terminal da lectina de Swartzia laevicarpa, assim como pode ser visto na Tabela 1,apresentou similaridade com outras cinco lectinas de leguminosas, sendo quatro delas provenientes desementes e apenas uma de advinda de casca. De acordo com Li et al. (2012), as lectinas de outrosórgãos vegetais, como folhas, cascas e raízes, podem apresentar grande homologia com lectinas desementes, indicando uma sequência de aminoácidos similar.Outro ponto relevante a se ressaltar entre as lectinas de Swartzia laevicarpa, Sophora japonica e Glycinemax é que todas possuem as seguintes características em comum: afinidade com N – acetil – D –galactosamina, estrutura em cadeia única e todas são glicosiladas. Além disso, as tribos filogenéticas detodas essas espécies estão evolutivamente próximas e descendem da tribo Swartzieae, na qual aSwartzia laevicarpa faz parte.Tabela 1: Análise comparativa da seqüência de aminoácidos da lectina da semente de Swartzialaevicarpa com as lectinas das sementes de Sophora japonica, da casca de Sophora japonica, dasemente de Vatairea macrocarpa e da semente de Gline Max e da semente de Luetzelburgia auriculata.A partir deste momento denominamos a lectina de sementes de Swartzia laevicarpa como SLL (Swartzialaevicarpa lectin)...4.Conclusão29,00928,994I Congresso de Iniciação Científica PIBIC/CNPq - PAIC/FAPEAM Manaus – 2012O extrato protéico de Swartzia laevicarpa apresentou, inicialmente, hemólise para todos os eritrócitostestados, provavelmente pela alta concentração de saponinas, característica desse gênero botânico.Por meio da cromatografia de troca iônica em DEAE – Sepharose e da cromatografia de afinidade α-Lactose - Agarose, conseguiu-se, respectivamente, remover as moléculas que causavam hemólise epurificar  a SLL.A eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS – PAGE) indicou que a SLL possui uma massa molecularde, aproximadamente, 29 kDa. A SLL é  formada por apenas uma subunidade e está ligadacovalentemente a carboidrato, ou seja, SLL é uma glicoproteína.A análise da estabilidade térmica indicou que a SLL é termoestável e por meio da espectrometria demassas, determinou-se que a massa molecular é igual a 29,009 kDa.Todos os resultados obtidos e aqui apresentados contribuem fortemente para o projeto “Moléculas compotencial antifúngico em sementes, folhas e casca de espécies arbóreas: prospecção, uso esustentabilidade da flora amazônica”. Pois, uma vez que se tem a lectina purificada, o próximo passoserá testá-la quanto a sua capacidade em  inibir fungos fitopatogênicos.5.Referências BibliográficasDe Hoff, P.L.; Brill, L.M.; Hirsch, A.M. 2009. Plant lectins: the ties that bind in root symbiosis and plantdefense. Mol. Genet. Genomics, 282: 1 - 15.Fernandes, A.V.; Ramos, M.V.; Gonçalves, J.F.C.; Maranhão, P.A.C.; Chevreuil, L.R.; Souza, L.A. 2011.Seeds of Amazonian Fabaceae as a source of new lectins. Brazilian Journal of Plant Physiology, 23: 237– 244.Freitas, C.D.; Ramos, M.V.; Souza, D.P.; Filho, J.D.B.M.; Teixeira, F.M.; Oliveira.; J.S. 2011. Correlaçõesentre atividade inseticida e resistência a proteólise de duas lectinas vegetais glicose/ manose.Comunicata Scientiae, 2: 34 - 41.Li, T.; Yin, X.; Liu, D.; Ma, X.; Lv, H.; Sun, S. 2012. Isolation and characterization of a novel lectin withantifungal and proliferative activities from Sophora alopecuroides seeds. Acta Biochimica et  BiophysicaSinica,1 – 8.Marqui, S.R.; Lemos, R.B.; Santos, L.A.; Gamboa, I.C.; Cavalheiro, A.J.; Bolzani, V.S.; Silva, D.H.S. 2008.Saponinas antifúngicas de Swartzia langsdorffi. Química Nova, 31: 828 - 831.Melo, V.M.M.; Vasconcelos, I.M.; Gomes, V.M.; Da cunha, M.; Soares, A.A.; Oliveira, J.T.A. 2005. Acotyledonary agglutinin from Luetzelburgia auriculata inhibits the fungal growth of Colletotrichumlindemuthianum, Fusarium solani and Aspergillus niger and impairs glucose-stimulated acidification of theincubation medium by Saccharomyces cerevisiae cells. Plant Science, 169: 629 - 639.Pinto, L.S.; Neto, M.A.; Bacarin, M.A.; Castellón, R.R.; Gadelha, T.S.; Gadelha, C.A.; Cavada, B.S. 2005.Caracterização química e bioquímica de sementes de Bauhinia variegata L. Revista Brasileira deEngenharia Agrícola e Ambiental, 9: 385 – 390.Rüdiger, H.; Gabius, H.J. 2001. Plant lectins: occurrence, biochemistry, functions and applications.Glycoconjugate Journal, 18:589-613.Sharon, N.; Lis, H. 1990. Legume lectins – a large family of homologous protein. The FASEB Journal, 4:3198 - 3208.

Purificação de Lectina(s) em Sementes de Swartzia Laevicarpa

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