Chagas, Daiane Cristine Negreiros Barbosa

Rafael, Míriam Silva

Portuguese

Repositório do INPA

Ministério da Ciência, Tesmhgb, Inovqiks e Connmicações ãiaidi(riboNtcauid&kq&m~daA - *  -de- - ~ A p o i o T e c n i c o  PROGRAMA DE INICIAÇÃO C I . I C A  DO INPA RELATORIO FINAL MAPEAMENTO DO SUPERCONTIG MADS - (FAMÍLIA DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO 2 (MEn)), EM CROMOSSOMOS POLITÊNICOS DE Anopheles darlingi, MANAUS, E S T A M )  DO AMAZONAS. BOLSISTA: Daiane Cristine Negreiros Barbosa Chagas ORIENTADOR(A): Dra. Mirim Silva Rafael Relatório Final apresentado ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, como requisito para a conclusão como participante do Programa de Iniciação Científica do INPA. Manaus - Amazonas 2017 Ministério da Ciência, Tecnologia, loovagbes e Comunicagaes -Nloiarl&AaprisPr<IhA " coadearçao~Clpscitgão DívisisoApoioTknico Título do Projeto do Orientador: Transcriptorna do mosquito Anopheles hlingi  Título do Plano de Trabalho do Bolsista: MAPEAMENTO DO SUPERCONTIG MADS POLITÊNICOS DE Ampheles darlingi, MANAUS, ESTADO DO AMAZONAS. Resumo: A malária é uma parasitose causada pelo p r o t o d o  PIamdum, transmitida por meio da picada do mosquito Emea que pertence ao gênero Ampheles, Filo Arthropoda, Classe Insecta, Ordem Diptera e Família Culicidae, que inclui todos os vetores conhecidos da malária humana. A caracterização de genes de interesse de mosquitos de importância epidemiológica, para o conhecimento de aspectos biológicos, evolutivos e controle vetorial tem sido realizada nas últimas décadas. Nesse sentido, o sequenciamento de genomas têm permitido comparações entre sequências gênicas de anofelinos, como o Anopheles gmbiae, principal vetor da malária na h c a ,  A. darlingi, vetor primário no continente sul-americano. Citam-se também o A. ae~ypti, transmissor dos vírus zica (zika), chicungunha (chikungunya) e dengue, e de Culex quinquefasciaíus, vetores de arboviroses e filariose, respectivamente. O supercontig me$? foi estudado, para uma melhor compreensão da variabilidade cromossômica de A. hlingi .  Os resultados mostraram o localização cromossômica de mej2 na região 43C, braço 3L. Após exaustiva busca do gene meJ2 em bancos genômicos públicos, este foi pouco estudado acerca de sua função. As proteinas mef2 do fàtor potenciador de miócitos incluem o's genes miosina, tropomiosina I e MLPóOA, os quais regulam músculos específicos. As proteínas de MeJ2 são uma família de fatores de transcrição que, por meio do controle da expressão gênica, regulam a diferenciação celular e desempenham um papel crítico no desenvolvimento embrionário, com; registrado em Drosophila melamgaster. O mapeamento fisico cromossômico, do gene me@, importante fator de transcrição, em A. darlingi, auxiliará estudos 'posteriores na compreensão da estrutura e organização do genoma e variabilidade cromossômica desse vetor primário de parasitos da malária, especialmente na Amazônia. Apoio F inmdm Palavras Chave: Mapeamento cromossômico, Ampheles ~ I z n g i ,  cromossomos politênicos, Hibridização In situ Florescente Subárea: Genética Financiamento: PIBICICNPq / I Data: ............... . , .. . . . . . . . . . . .  Apoio Finaaoello: At<aiUU& &*&baP3r, Bolsista PROGRAMA DE INICIAÇAO CIENT~F'ICA DO INPA RELAT~RIO FINAL Sequências de interesse do genoma e transcriptoma de A. darlingi têm sido mapeadas em cromossomos politênicos desse mosquito, tais como, os genes actina (Bridi et al., 2013), miosina e arrestina (Grangeiro, 2013), GNBP (Bridi & Rafael2016) e vitelogenina (Azevedo et al., 2015), por meio do método de RSH. A sequência do superlontig U D S  (família de fatores de transcrição = box transcription enhancer factor 2 (mef2)) do genoma de A. darlingi (Rafael, dados não publicados) apresenta similaridade com A. gambiae (AgaP_ENSANGG00000023374). Também em Drosophila melanogaster, o gene me@ foi descrito com a função de responder a sinais extracelulares e ativar fatores genéticos, que controlam a diferenciação celular, sendo essencial para o desenvolvimento da musculatura larva1 desse mosquito. O promotor de transcrição MADS é uma região de 56 aminoácidos conservada encontrada dentro do domínio de ligação ao DNA de diversos organismos eucariotos (Shore & Sharrocks, 1995). A literatura não registra mapeamento físico do gene me@ em cromossomos de A. darlingi. No presente estudo, o Superlontig mef2 do genoma de A. darlingi será mapeado in situ, para preencher gap (lacuna) na descrição do genoma deste mosquito e, também, conhecer a evolução do Supercontig mef2 em seus cromossomos politênicos. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Captura de Material As capturas de A. darlingi foram realizadas em Manaus: Madeireira Portela (S 03" 05 19' 5" e W 05" 98 92' 62"), Puraquequara (Figura 1). A identificação foi realizada, segundo Consoli & Lourenço-de-Oliveira (1994), Faran & Linthicum (1981) e Forattini (1962). Apoio Financeiro: PROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DO INPA RELAT~RIO FINAL Figura 1. Mapa da área de estudo e imagem do local de coleta. Fonte: criadouro de mosquito no Bairro Puraquequara, AM (Guimarães, 2014). 2.2 Preparações de lâminas com cromossomos politênicos de A. darlngi As preparações citológicas dos cromossomos politênicos de A. darlingi foram realizadas, segundo French et al. (1962) e Kumar e Collins (1994), com modificações para A. darlingi (Rafael et al. 2004). As Larvas de 4" estádio foram utilizadas para as preparações cromossômicas, a partir de glândulas salivares extraídas do protórax sobre as quais foram adicionados os fixadores I (1,5 mL Camoy: 5 mL água destilada), 11 (2 mL Camoy: 2 mL água destilada) e I11 (2 mL ácido lático 90%: 2 mL água destilada). Sobre os cromossomos foi adicionada lamínula siliconizada e o material esmagado entre lâmina e lamínula (Figura 2). Figura 2. Preparações de lâminas com cromossomos politênicos de A. darlingi Apoio Ficeiro: PROGRAMA DE INICIAÇAO CIENTÍFICA DO INPA RELAT~RIO FINAL As lâminas foram transferidas para refrigerador a 4 OC, em um recipiente com papel toalha umedecido com água destilada, por 12 horas. Em seguida, as lamínulas foram removidas em nitrogênio líquido e foram desidratadas em Etanol a 50%, 70%, 90% e 100%, por 5 minutos, cada. Após secagem das lâminas, estas, foram mantidas em refrigerador a 20°C negativos. 23. Hibridizaçiío in situ Fluorescente- FISH 2.3.1 Marcaçiío do SuperContig mefl de A. darlingi por Nick Translation System(Invitrogen) A sequência do SuperContig mef2 de A. darlingi está clonado em um fosmídeo, inserido no vetor de clonagem pCMV SPORT6 (INVITROGEN) foi obtido do genoma desse mosquito, disponível no Laboratório de Citogenética, Genômica e Evolução de Mosquitos, COSAS,INPA, Manaus - AM e foi marcado como sonda, com o kit Nick translation (Enzo cat. no 42710-16). Em um microtubo (1,5 mL) foram adicionados 2,5 pL de tampão 10x DNA-polimerase, 2,O pL dNTP (minus clATP) mir; BSA 0.5 mglmL, DNA (500 ng a 1 gg), 1,O pL cye3r dUTP ( ~ m e r s h a m ~ ) ,  DNAse 1 (0.02U), 2,O pL DNA Polimerase e completado o volume total para 25 uL água Milli - Q autoclavada. A sonda foi incubada 15 'C, por 2h30 min. A sonda foi homogeneizada e mantida 16T, 3 horas. 2.3.2 PurificaçHo da sonda DNA de Salmon (1/10) do volume total da sonda e NaAc (3M) foram adicionados. A sonda foi purificada com Etanol (100% PA) a 1/10 do volume total da reação; Acetato de Sódio a 3M. A sonda foi mantida a 80 OC negativos overnight. O material foi centrifugado a 4' C, 14,000 rpm, 10 min. O sobrenadante descartado e o DNA fosmidial foi desidratado e diluído em solução de Hibridizaçáo 2x (0.2 g Sulfato Dextran + Formamida ultra pura+ H20 + 20 x SSC) previamente aquecida a 37°C. O material foi misturado e centrifugado antes do uso. 2 3 3  Pré-tratamento das lâminas C As lâminas depois de mergulhadas em tampão PBS lX, durante 20 minutos foram transferidas para solução de paraformaldeido 4%, por 1 minuto, para desnaturação dos cromossomos. As lâminas f o r a .  desidratadas em etanol50%, 70%, 90% e 100%, por 5 minutos. Foram secas ao ar Apoio financeiro: PROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENT~FICA DO INPA RELAT~RIO FINAL Os cromossomos foram corados em 30 uL de solução YOYO 10X (Invitrogen - 895247, USA) diluídos em 270 uL de PBS lX, em seguida adicionados 100 pL em cada lâmina, e cobertas com parafilme. As lâminas permaneceram em TA, por 10 minutos, logo após o parafilme foi removido com jatos de PBS lx. Posteriormente foram adicionados 10 pL de Prolong Gold antfade (Me - P36934, USA) e adicionada uma lamínula de 22x22mm. As lâminas permaneceram a T.A, durante 10 minutos. Posteriormente mantidas a 4°C e protegidas da luz. 2.5. Microfotografias: Os cromossomos politênicos foram fotografados com maquina fotográficos digitais e analisados em microscópio de luz Axioplan Zeiss, campo claro com objetiva de 40x e 100x(com 61eo de irnersão) e ocular projectiva 1W25. 3. Resultados O Blastx da sequência do gene me$? de A. darlingi (htt~s://www.vectorbase.or~, após a anotaçáo, foi realizado como segue: FEATURES Localiza@o / qualificadores fonte 1..33303 / Organismo = "Anopheles darlingi" 1 Db-xref = "taxon: 43151" complemento gene (contig-15: 263 1 ..6745) / Gene = ADAC002704 / Nota = "MADS-box transcrição fator potenciador 2, invertebrados [Fonte: Projetada de Anopheles gambiae (AGAP007608) VB descrição externa; Prec: AGAP0076081 " mRNA join (complemento (657. .7 10), complemento (373. .576) D Por meio do método de FISH foi obtido o sinal fluorescente do superconhg meJ2 (sonda Pb22b) de A. darling,. O gene me@ mapeou em um único sitio do braço cromossômico 3L, região Apoio Financeiro: PROGRAMA DE INICIAÇÃO C I E N T ~ C A  DO iNPA RELAT~RIO FINAL O mapeamento í%ico cromossômico, do gene mef2, importante fator de transcrição, na região de inversão 43 C (braço 3L) de A. darlingi, auxiliará estudos posteriores na compreensão da estrutura e organização do genoma e variabilidade cromossômica desse vetor primário de parasitos da malária, especialmente na Amazônia. Azevedo, K M. D. ; Bridi, LC. ; Rafael, M. S. 2015. Mapeamento Físico e Evolução Cromossômica do Gene vitelogenina de Anopheles darlingi, da Amazônia Central. In: IV Congresso de Iniciação CientiJica (CONIC), do INPA-PIBIC/CNPq/PAIC/FAPMM, Manaus-AM, 20 de julho 2015. Bour, B. A.; Chakravarti, M.; West, J.M., Abmayr, S. M. 2000. Drosophila SNS, a member of the immunoglobulin superfamily that is essential for myoblast fusion. Genes & Development 14:1498- 1511. Bridi, L.C.; Rafael, M.S. 2016. GNNP domain of Anopheles darlingi: are polymorphic inversions and gene variation related to adaptive evolution? Genetica, DOI 10.1007/s10709-016-9881-6 Bridi, L.C; Sharakhova, M.V; Sharakhov, LV, Cordeiro, J; Azevedo-Junior, G.M; Tadei, W.P; Rafael, M.S., 2013. Chromosomal localization of actin genes in the malaria mosquito Anopheles darling. Medica1 and Veterinary Entomology. 27,118-121. Bour, B. A.; Chakravarti, M.; West, J.M., Abmayr, S. M. 2000. Drosophila SNS, a member of the immunoglobulin superfamily that is essential for myoblast fusion. Genes & Development 14:1498- 1511. Cornell, A.J.; Brisco, K K; Tadei, W.P.; Secundin0N.F.C.; Rafael, M.S.; Galardo, A.KR.; Medeiros, J.F.; Pessoa, F.A.C.; Nos-Velásquez, C.M.; Lee,Y .; Pimenta, P.F.P.; Lanzaro, G.C. 2016 Anopheles darlingi polytene chromosomes: revised maps including newly described inversions and evidence for population structure in Manaus. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. lll(5): 335-346. 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Mapeamento do supercntig MADS (Família de Fatores de Transcrição 2 (MEF2)), EM Cromossomos politênicos de Anopheles darlingi, Manaus, Estado do Amazonas

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Mapeamento do supercntig MADS (Família de Fatores de Transcrição 2 (MEF2)), EM Cromossomos politênicos de Anopheles darlingi, Manaus, Estado do Amazonas

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