Desmin, a basic intermediate filament protein specific to muscle tissue, facilitates the transmission of force during muscle contraction and relaxation by forming a large network structure that allows the myofibrils to connect to the nucleus, sarcolemma and intracellular organelles. In animal models used to understand the underlying pathophysiology of DES-related diseases, it is necessary to analyze tissues in which orthologous genes are expressed. In the zebrafish, which has many advantages in modeling muscle diseases, there are two DES orthologous gene (desma and desmb). In our preliminary studies conducted by our group with in situ hybridization experiments in wild-type AB zebrafish, it has been shown that the desma and desmb transcripts have similar skeletal muscle expression pattern until 70th hour after fertilization; but after 70 hours, it was observed that the desma was expressed predominantly in skeletal muscle, while desmb was expressed highly in the smooth muscle. In the thesis study, it was aimed to investigate mRNA and protein expressions of desma and desmb in wild type AB, desma KO (-/-) and desmb KO (-/-) zebrafish embriyos. In the quantitative real-time PCR study, 99% of desma mRNA expression in desma KO (-/-) fishes and 98% of desmb mRNA expression in desmb KO (-/-) fishes were found to decrease relative to wild type AB fish. Whole-mount in situ hybridization and whole-mount immunofluorescence staining studies have shown that desma in desmb KO (-/-) zebrafish is also expressed in the gut, additional to skeletal and cardiac muscle. However, it was observed that in the desma KO (-/-) fish, the desmb was mostly expressed in smooth muscle from the 70th hour after fertilization and that no expression occurs in skeletal muscle in the absence of desma.İÇİNDEKİLER
ONAY SAYFASI iii
YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv
ETİK BEYAN v
TEŞEKKÜR vi
ÖZET vii
ABSTRACT viii
İÇİNDEKİLER ix
SİMGELER VE KISALTMALAR xii
ŞEKİLLER xiii
TABLOLAR xvi
1. GİRİŞ 1
1.1 İskelet Kası İşlevi ve Hastalıkları 1
1.2 Desmin ve Desminopatiler 1
1.3 Zebra Balığı ve Desmin 2
1.4 Amaç ve Kapsam 3
2. GENEL BİLGİLER 4
2.1 İskelet Kası Yapısı 4
2.2 Sarkomerik Hücre İskeleti 5
2.2.1 İskelet Kası Ara Filament Proteinleri 6
2.3 Desmin 7
2.3.1 Desminopatiler 9
2.4 Zebra Balığı (Danio rerio) 10
2.4.1 Zebra Balığında İskelet Kası Yapısı 11
2.4.2 Zebra Balığında İskelet Kası Hastalıklarının Modellenmesi 12
2.4.3 Zebra Balığında Desmin 13
3. GEREÇ VE YÖNTEM 15
3.1 Zebra Balıkları ve Gereçler 15
3.1.1 Çalışmada İncelenen Zebra Balıkları 15
3.1.2 Zebra Balıklarının Bakımı ve İdamesi 16
3.1.3 DNA İzolasyonu 17
3.1.4 Primer Dizilerinin Tasarlanması 17
3.1.5 Polimeraz Zincir Reaksiyonu 17
3.1.6 DNA Agaroz Jel Elektroforezi 18
3.1.7 DNA Dizi Analizi 18
3.1.8 Zebra Balığı Embriyolarının Fiksasyonu 19
3.1.9 Total RNA İzolasyonu 19
3.1.10 cDNA Sentezi 19
3.1.11 Prob Sentezi 20
3.1.12 Tüm Örnek İn Sitü Hibridizasyon ve Dondurulmuş Kesitler 21
3.1.13 Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu 23
3.1.14 Tüm Örnek İmmünfloresan Boyama 23
3.2. Yöntemler 24
3.2.1 Zebra Balıklarının Bakımı ve İdamesi 24
3.2.2 Zebra Balığı Kuyruk Dokusundan DNA İzolasyonu 24
3.2.3 desma ve desmb İçin Yapılan PZR ve DNA Dizi Analizi Çalışmaları 25
3.2.4. Zebra Balığı Embriyolarının Fiksasyonu 29
3.2.5. Zebra Balığı Embriyolarından Total RNA İzolasyonu 30
3.2.6 cDNA Sentezi 32
3.2.7. İn Sitü Hibridizasyon Çalışmaları İçin Prob Sentezi 33
3.2.8 Tüm Örnek İn Sitü Hibridizasyon ve Dondurulmuş Kesitler 36
3.2.9. Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu 39
3.2.10. Tüm Örnek İmmünfloresan Boyama 41
4. BULGULAR 43
4.1 DNA Dizi Analizi ile desma KO (-/-) ve desmb KO (-/-) Zebra Balıklarının Belirlenmesi 43
4.2 desma ve desmb İfadesinin Kantitatif Gerçek Zamanlı PZR ile Analizi 48
4.3 Zebra Balığı Embriyolarında Tüm Örnek ve Dondurulmuş Kesitlerde İn Sitü Hibridizasyon 53
4.4 Zebra Balığı Embriyolarında Tüm Örnek İmmünfloresan Boyama 61
5. TARTIŞMA 65
6. SONUÇ VE ÖNERİLER 75
6.1 Sonuç 75
6.2 Öneriler 76
7. KAYNAKLAR 77
8. EKLER
EK 1: Tez Çalışması ile İlgili Etik Kurul İzni. 82
EK 2: Vimentin İfadesinin kGZ-PZR Çalışması İle Analizi. 84
EK 3: Erişkin Zebra Balıklarının Kas Dokusundan Alınan Kesitlerde Gerçekleştirilen Hematoksilen Eozin Boyaması. 85
9. ÖZGEÇMİŞKas dokusuna özgül temel ara filament proteini olan desmin, miyofibrillerin çekirdek, sarkolemma ve hücre içi organellerle bağlantılarını sağlayan geniş bir ağ yapısı oluşturarak, kas kasılması ve gevşemesi sırasında güç aktarımını kolaylaştırmaktadır. Desmin geni (DES) ile ilişkili hastalıkların altında yatan patofizyolojinin anlaşılması için kullanılan hayvan modellerinde, ortolog genlerin ifade olduğu dokuların analiz edilmesi gerekmektedir. Kas hastalıklarını modellemede birçok avantajı bulunan zebra balığında, DES ortoloğu iki homolog gen (desma ve desmb) bulunmaktadır. Grubumuz tarafından, yabanıl tip AB zebra balıklarında in sitü hibridizasyon deneyleri ile gerçekleştirilen ön çalışmalarda, desma ve desmb transkriptlerinin döllenmeden sonra 70. saate kadar benzer iskelet kası yerleşimi gösterdiği; ancak 70. saatten sonra, desma ağırlıklı olarak iskelet kasında ifade olurken, desmb‘nin çoğunlukla düz kasta ifade edildiği gözlenmiştir. Tez çalışmasında, desma ve desmb’nin mRNA ve protein ifadelerinin, yabanıl tip AB, desma KO (-/-) ve desmb KO (-/-) zebra balıklarında karşılaştırılarak araştırılması amaçlanmıştır. Kantitatif gerçek zamanlı PZR çalışmasında, yabanıl tip AB balıklara göre, desma KO (-/-) balıklarda desma mRNA ifadesinin %99 ve desmb KO (-/-) balıklarda desmb mRNA ifadesinin %98 oranında göreceli olarak azaldığı bulunmuştur. Gerçekleştirilen tüm örnek in sitü hibridizasyon ve tüm örnek immünfloresan boyama çalışmalarında, desmb KO (-/-) zebra balıklarında desma’nın, iskelet kası ve kalp kasının yanında, bağırsakta da ifade olduğu saptanmıştır. Ancak, desma KO (-/-) balıklarda, desmb‘nin 70. saatten itibaren çoğunlukla düz kasta ifade olduğu ve desma yokluğunda iskelet kasında ifade olmadığı gözlenmiştir
